嗅球的四次免疫染色用于嗅觉感觉轴突分子识别码的可视化
Summary
嗅觉神经元表达各种各样的轴突分选分子，建立适当的神经电路。该方案描述了一种免疫组织化学染色方法来观察嗅觉神经元轴突末端的轴突分选分子的组合表达。
Abstract
由于其简单的解剖结构，小鼠嗅觉系统通常用于研究神经回路形成的机制。嗅觉神经元（OSN）是具有单个枝晶和单个无分支轴突的双极细胞。 OSN仅表达一个嗅觉受体（OR）基因，表达给定类型的OR的OSN将其轴突收敛于嗅球（OB）中的几组不变的肾小球。 OSN预测的一个显着特征是表达的ORs在轴突投影中起到指导作用。 ORs调节多个轴突分选分子的表达，并在OSN轴突末端产生轴突分选分子的组合分子代码。因此，要了解OR特异性轴突引导机制的分子机制，在同一肾小球中的OSN轴突末端表征其表达谱是至关重要的。本文的目的是介绍收集尽可能多的肾小球的方法e在单个OB部分上，并使用多个抗体进行免疫染色。这将允许比较和分析轴突分选分子的表达模式，而在OB部分之间没有染色变异。
Introduction
在发育过程中，神经元彼此精确连接，形成适当的神经回路，这对正常脑功能至关重要。由于大脑中的异常神经回路被认为是自闭症和精神分裂症等精神障碍的原因，因此了解神经回路形成的机制是神经科学领域的主要挑战之一。
在小鼠嗅觉系统中，嗅觉上皮（OE）中的每个嗅觉感觉神经元（OSN）仅表达一个功能性嗅觉受体（OR）基因，并且表达相同OR的OSN在其定型位置收敛其轴突到特定的一对肾小球嗅球（OB） 1，2 。小鼠嗅觉系统是研究神经回路形成的分子机制的优秀模型系统，因为研究人员可以利用OR表达来识别特定的sOSN的ubtype和可视化OSN轴突的投影位点作为清晰的肾小球结构。 OSN投射的一个显着特征是ORs在将OSN轴突投影到OB 3，4，5，6等方面发挥了指导作用。更具体地说，在OSN轴突被引导到近似目标区域之后，它们以OR依赖的方式被分离以形成肾小球。以前的研究表明，OR分子控制轴突分选分子的表达，调节肾小球分离7,8 。此外，积累的证据表明OR分子通过轴突分选分子9的独特组合产生神经元识别码。因此，为了理解OR依赖性肾小球分离的机制，有必要表征轴突分选的表达谱OSN中的ecules。
荧光免疫染色是可视化特定基因表达的常用方法。由于轴突分选分子的蛋白质主要定位于OSN轴突，研究人员需要使用OB部分来表征其在OSN中的表达模式。 OB的冠状切片常规用于免疫染色。然而，该制剂在相同的OB部分中沿着前后轴线丢失了地形信息。因此，我们开发了OB的内侧的旁侧制剂，其可以在相同的OB部分上安装尽可能多的周围的肾小球。结合使用多种抗体的免疫染色，该制剂允许比较和分析轴突分选分子的表达模式，而在OB部分之间没有染色变异。
此外，已经提出了免疫组织化学染色方法，而不需要用PFA a进行固定nd蔗糖处理。这种方法允许研究人员获得足够高质量的染色数据进行多变量数据分析。本文介绍的方案将为研究嗅觉神经电路形成的研究人员提供有力的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
旁分泌OB部分的四次免疫染色使得能够在大量肾小球中同时观察和定量多达四个轴突分选分子的表达水平。通过用PCA分析这些多变量数据，可以推测这些分子表达的特征。
为了成功染色，组织样品制备至关重要。一些方案表明组织应用4％PFA后固定，并用30％蔗糖处理以进行冷冻保护。但是，在本协议中省略了这些步骤。这是因为在许多情况下，这些步骤减少染色信号强度并增…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了三菱基金会，武田科学基金会，JST PRESTO和JSK KAKENHI Grant Number 16H06144的支持。
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
Riferimenti
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