여기를 사용 하 여 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (HR-SD-10 월) subretinal 공간으로 유전자 치료 대리인의 납품을 지원, 그 영역 범위를 평가 하 고 포토 리셉터 활력을 특성화 새로운 접근 방식을 설명 합니다.
HR-SD-10 월은 라이브 마우스 모델에서 포토 리셉터 변성의 진행을 모니터링, 평가 subretinal 공간으로 치료제의 배달 독성과 효능에서 vivo에서평가 하 고 활용. HR-SD-10 월 적외선 (800-880 nm) 근처를 사용 하 고 광학 특히 하위 2 미크론 축 해상도 마우스 눈의 독특한 광학에 대 한 설계 되었습니다. 유전자 변형 마우스 모델 외부 망막 (포토 리셉터) 변성 및 컨트롤의 질병의 진행을 평가 하기 위해 몇 군데 있었다. 가져온된 유리 바늘 제공 adeno 관련 바이러스 (AAV) 또는 나노 (NP) 를 통해 하위 망막 주사 트랜스 scleral 트랜스 안 접근 하 사용 되었다. Subretinal 공간으로 바늘의 위치 주의 하위 망막 공간으로 액체를 제공 하는 보정된 압력 주입 전에 필요 했다. 실시간으로 subretinal 수술 이미징 시스템 (RIS) 우리의 망막에 실시 됐다. HR-SD-10 월 시연 한 독성 돌연변이 인간 돌연변이 rhodopsin (P347S)의 표현으로 인해 진보적인 유니폼 망막 변성 (P347S) transgene 쥐에서. HR-SD-10 월 모든 망막 층의 엄격한 정량화를 허용 한다. 외부 핵 층 (ONL) 두께 및 포토 리셉터 외부 세그먼트 길이 (OSL) 측정 포토 리셉터 활력, 변성, 또는 구조와 연관. RIS 배달 시스템 수 있습니다 subretinal 주사의 실시간 시각화 신생아 (~ P10-14) 또는 성인 쥐, 및 10 월 HR-SD 즉시 배달의 성공을 결정 하 고 지도 영역 범위. 10 월 인사-SD 대뇌 비보의 활력 측정 또한 쥐, subretinal 수술의 성공을 평가할 수 있는 강력한 도구입니다. HR-SD-10 월 망막 변성, 독성, 그리고 전 임상 유전자 치료 연구에서 치료 구조의 정도 평가 하기 위해 균일 한 동물 동료를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.
인간의 질병1,2,,34 에 대 한 치료로 번역 하는 새로운 치료의 희망으로 망막과 망막 퇴행 성 질병의 다양 한 유전자 요법을 개발 하는 연구원 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. 시간 영역 또는 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 외부 망막 변성 질환12,13,14의 특정 마우스 모델의 측면을 조사 하는 데 사용 되었습니다 . 그러나 HR-SD-10 월, 되지 않았습니다 광범위 하 게 속도 망막 변성의 공간적 균일성을 결정 하기 위해 최적화 마우스 모델의 평가의 맥락에서 사용 또는 유전자의 전 임상 평가의 맥락에서 기반 치료제, 예를 구조, 독성, 또는 벡터 배달8,,1516의 공간 범위를 평가 합니다. 일단 마우스 모델 특징 완전히 HR-SD-10 월 데이터 구조 또는 망막 변성17의 마우스 모델에서 독성을 발휘 하는 치료제의 영향을 측정 하는 유익 하 고 신뢰할 수 있는 리소스로 사용할 수 있습니다. 많은 그룹은 대뇌와 망막 안료 상피 (RPE) 셀 시험에 그것의 효율성 때문에 벡터 배달의 방법으로 subretinal 주입을 사용 하 여. 그러나, 그것은 일반적으로 각 막 표면에서 직접 수술에 의해 수행 하 고 백 내장, 출혈, 그리고 뒷부분의 조작 하면 발생 하는 의도 하지 않은 망막 분리에 따른 자주 다 마스터, 어려운 방법 남아 유리. 많은 그룹은 여전히 맹목적으로 subretinal 주사를 시도 하 고 비교적 큰 직경 스테인리스 바늘 (34g)8,,1718,19와 수동 주사를 사용 하 여 바이러스를 전달 ,20,,2122, 그리고 몇 사용 광학 일관성 단층 촬영 (10 월) 망막8,17, 에 벡터의 적절 한 배달 확인을 이미징 20 , 22. 몇 가지 개선 방법에는 최근 설명 눈금 바늘 micromanipulator22에 의해 주도 사용 하 여.
우리는 바늘의 위치에서 에이즈는 통합 된 접근 방식을 제시 하 고 주사 사용자 지정 지시 스테레오 ophthalmoscope 마우스17, 의 작은 눈 내 머릿속에 맞게 실험실에서 설계에 의해 촉진 된다 23. stereotaxic micromanipulator와 함께에서 가져온된 유리 마이크로 바늘의 사용 이전에 바늘 배치 필요 (즉, conjunctivae 및 결합 조직 통해) 아래로 수술 커트의 더 나은 제어를 제공 사출입니다. 압력의 사용 규제 마이크로 인젝터 도움이 제공 일관 된 주입 볼륨, 그리고 주사 훨씬 더 중대 한 안정성, 정밀, 그리고 휴대용 주사기, 감소에 의해 수행 하는 수동 주사 보다 훨씬 더 느리게 할 수 있는 눈에 거품 주입 발생 작은 바늘 경로가 자체 봉인 때문에 바늘 철수에 따라 누설을 방지할 수 있습니다. 사출/배달의 정도 평가 하기 위해 많은 조사 그룹 찾기 및 실험 끝에 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식 (식 구조는 벡터에 의해 전달) 망막에서의 면적 범위를 평가에 의존 (안락사) 성공적인 주사11,19,,2024확인 가리킵니다. 이 접근 (10 월을 활용 하지) 수술 성공 이후 수술 (알 수 없음된) 오류와 함께 모든 동물 필요가 유지 될 때까지 반복 측정을 가진 뒤 수술 절차 시간에 동물, 엄청난 양의 자원 낭비 확인 안락사와 눈 추수 (때 EGFP 측정 된다). 주사 (즉 subretinal 공간) 망막의 정확한 레이어 사이 보여주는 시간-SD-10 월을 사용 하 여 망막에 주입의 위치 확인을 개선할 수 있습니다. 10 월 인사-SD 즉시 접근 향상을 실제 수술 시간 관련 변수를 식별 하기 위해 (수술 실패) 시도 실패 윤곽을 그리 다 사용할 수 있습니다. 우리는 HR-SD-10 월 이점을 제공 합니다 수많은 임상 유전자에서 치료 연구 외부 망막 변성의 급속 한 양적 평가 함으로써 식별/실험 기준 ( 에 부합 하지 않는 연구 동물의 도태 수 발견 예를 들어, 잘못 된 subretinal 주입), 직접 어디 벡터 (여기서 전 임상 효과 가장 가능성이) 배달 되었다 눈의 지역에 따라 영상으로 벡터 배달 되지 않았습니다 영역을 제어 하 고. 개발 이후 SD OCT를 사용 하 여 허용 하 고 안과 연구자에 의해 사용을 계속 하고있다 그리고 이제 마우스 또는 설치류 모델13,25에서 망막 과학적 연구에서 망막 이미징의 표준으로 간주 됩니다. 10 월 인사-SD 및 그것의 소프트웨어 기능을 동물 모델 선택, 선택에 변성의 특성을 포함 하 여 프로세스의 모든 단계에서 마우스 모델에서 성공적인 정량 유전자 치료의 목표를 추가로 독특한 통합 방식에서 이용 하였다 질병 모델, 치료 배달, 벡터를 전달 하며, 독성/효능 평가의 매핑. HR-SD-OCT를 사용 하 여 프로세스의 모든 수준에서 더 효율적인 약물 발견에 대 한 수 있습니다. 여기 우리의 RNA 약물 발견 프로그램에 사용 되는 이러한 접근 방법을 설명 합니다.
10 월 인사-SD 잠재적인 치료제 테스트에서 그들의 유용성을 결정 하는 인간 질병의 잠재적인 동물 모델의 특성에 대 한 간단한 방법을 제공 한다. 신속 하 고 안정적으로 인간 질병의 잠재적인 동물 모델의 특성 수는 (예를 들어, 교체 유전자 치료, ribozyme 또는 shRNA 최저의 유전자 치료, 결합 된 유전자 치료) 치료 약물 발견의 과정에 중요 합니다. HR-SD-10 월 특성화 및 거의 모든 마우스 모델에…
The authors have nothing to disclose.
이 자료는 학과의 재향 군인 담당 (버지니아), 재향 군인의 건강 관리, 사무실의 연구와 개발 (생물 의학 실험실 연구 및 개발)에 의해, 부분적으로, 지원 작업 기반 (VA 공로 그랜트 1I01BX000669). JMS는 고용, 부분적으로로 직원 의사-과학자, 안과, 버지니아 WNY; MCB VA WNY에 의해, 부분적으로, 채택 된다. 연구, 실시 하 고, 참전 용사 관리 서양 뉴욕 의료 시스템 (버팔로, 뉴욕)에 의해 부분적으로 지원 했다. 내용 재향 군인 담당 부서 또는 미국 정부의 의견을 대표 하지 않는다. 도 지원, 주요 부분에서 네이 NIH R01 부여 함으로써 EY013433 (PI: JMS), NIH/네이 R24 부여 EY016662 (UB 비전 인프라 센터, 파이: M 학살, 감독-Biophotonics 모듈: JMS), 무제한 부여 하는 학과의 안과/대학에서 실명 방지 (뉴욕), 연구에서 버팔로 그리고 Oishei 재단 (버팔로, 뉴욕)에서 부여. 우리 인정 hC1 유전자 변형 로P347S 선 및 exon 1 마우스의 선물 (Tufts 뉴잉글랜드 의료 센터, 보스톤, MA), 박사 제 니스 렘에서 로 녹아웃 heterozygous 상태에 NHR E transgene 모델의 선물에는 마우스 exon 2로 녹아웃 배경 박사 G. 제인 파라와 피터 험프리 (삼위일체 대학, 더블린, 분노).
C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
N129R- | N/A | N/A | |
2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
Forceps | Milton | 18-825 | |
Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
Windows Excel | Microsoft | N/A | |
Adobe Illustrator | Adobe | ||
Scale | Mettler | ||
Scissors | World Precision Instruments | ||
Ear punch | Nat’l band | ||
CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
Heating plate | In House | N/A | |
Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
Contact lenses | In-house | N/A | |
Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |