Her viser vi en ny tilnærming til å bruke høy oppløsning spectral domener optical coherence tomografi (HR-SD-oktober) å hjelpe levering av gene terapi agenter i subretinal plass, vurdere dekningen areal og karakteriserer photoreceptor vitalitet.
HR-SD-oktober benyttes å overvåke utviklingen av photoreceptor degenerasjon i levende mus modeller, vurdere levering av terapeutiske agenter i subretinal plass, og å vurdere toksisitet og effekt i vivo. HR-SD-oktober bruker nær infrarødt lys (800-880 nm) og har optikk spesielt utviklet for unike optikk musen øyet med sub-2-mikron aksial oppløsning. Transgene musen modeller av ytre retinal (photoreceptor) degenerasjon og kontroller ble fotografert for å vurdere sykdomsprogresjon. Trakk glass microneedles ble brukt til å levere sub retinal injeksjoner av adeno-assosiert virus (AAV) eller nanopartikler (NP) via en trans-Innbukking og trans-choroidal tilnærming. Nøye plassering av nålen i subretinal plass var nødvendig før en kalibrert trykk injeksjon, som leverer væske inn i sub retinal plass. Sanntid subretinal operasjonen ble utført på vår retinal imaging system (RIS). HR-SD-oktober vist progressiv uniform retinal degenerasjon på grunn av uttrykk for en giftig mutant menneskelige mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene i mus. HR-SD-oktober kan strenge kvantifisering av alle retinal lagene. Ytre kjernefysiske lag (bare) tykkelse og photoreceptor ytre segmentet (OSL) lengdemål korrelerer med photoreceptor vitalitet, degenerasjon eller redning. RIS leveringssystemet gir sanntids visualisering av subretinal injeksjoner i neonatal (~ P10-14) eller voksen mus og HR-SD-oktober umiddelbart avgjør suksessen til levering og kart areal grad. HR-SD-oktober er et kraftig verktøy som kan evaluere hvor vellykket subretinal kirurgi i mus, i tillegg til å måle vitalitet av fotoreseptorer i vivo. HR-SD-oktober kan også brukes til å identifisere uniform dyr kohorter å vurdere omfanget av retinal degenerasjon, giftighet og terapeutiske redning i preklinisk gene terapi forskningsstudier.
Forskere utvikler gen-terapi for en rekke netthinnen og netthinnens degenerative sykdommer med håp om å oversette romanen therapeutics til behandlinger for menneskelig sykdom1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tid domenet eller spektrale domene optical coherence tomografi (SD-oktober) er brukt til å undersøke aspekter av ytre retinal degenerasjon i bestemte musen modeller av sykdom12,13,14 . HR-SD-oktober er ikke, men mye brukt i forbindelse med optimalisering evaluering av musen modeller for å bestemme hastigheten og romlig sıtt retinal degenerasjon, eller i forbindelse med prekliniske evaluering av genet basert therapeutics, for eksempel til vurdere redning, toksisitet eller romlige omfanget av vektor levering8,15,16. Når en musemodell er fullt preget, kan HR-SD-oktober dataene tjene som en informativ og pålitelig ressurs å måle virkningen av therapeutics å utøve redning eller toksisitet i musen modeller retinal degenerasjon17. Mange grupper bruker subretinal injeksjon som vektor levering på grunn av sin effektivitet på transducing fotoreseptorer og netthinnens pigment epitel (RPE) celler. Men dette er fortsatt en vanskelig metode å mestre, gitt at det utføres vanligvis av fri hånd kirurgi fra hornhinnen overflaten, og er ofte fylt med cataracts, blødning og utilsiktede retinal detachments forekommer ved manipulering av bakre glasslegemet. Mange grupper fremdeles prøver subretinal injeksjoner blindt og levere viruset benytter manuell injeksjoner med relativt stor diameter rustfritt stål nåler (34G)8,17,18,19 ,20,21,22og noen bruker optical coherence tomografi (OCT) for å bekrefte riktig levering av vektor netthinnen8,17, 20 , 22. noen forbedringer i metoden har nylig blitt beskrevet over Mikroskala pinner drevet av en micromanipulator22.
Vi presenterer en integrert tilnærming som hjelpemidler i plasseringen av nålen og injeksjoner er tilrettelagt av en egendefinerte instruert stereo oftalmoskop utviklet i laboratoriet for se i lille øyet mus17, 23. Bruk av trakk glass mikro nåler i forbindelse med den stereotaxic micromanipulator gir bedre kontroll med nål plassering med ingen kirurgisk kuttet ned nødvendig (dvs. gjennom conjunctivae og bindevev) før injeksjon. Bruken av trykket regulert mikro injektor hjelper levere konsistent injeksjon volumer og injeksjon kan gjøres med mye større stabilitet, presisjon og mye tregere enn manuell injeksjoner utført av en håndholdt sprøyte, og dermed redusere den forekomst av boble injeksjon i øyet. Mindre nålen hindrer lekkasje etter nålen uttak fordi banen er selvtettende. For å vurdere omfanget av injeksjon/levering, stole mange undersøkende grupper på å finne og vurdere areal omfanget av forbedret grønne fluorescens protein (EGFP) uttrykk i netthinnen (uttrykk konstruere levert av vektor) på eksperimentell slutten Velg (euthanasia) bekrefte vellykket injeksjoner11,19,20,24. Denne metoden (ikke benytte OCT) for å bekrefte kirurgisk suksess avfall en enorm mengde ressurser kirurgisk fremgangsmåter og dyr, siden alle dyr med (Ukjent) kirurgisk feil må opprettholdes, etterfulgt med repeterende tiltak til Eutanasi og øye innhøstingen (når EGFP er målt). Bekreftelse av plasseringen av injeksjon i netthinnen kan forbedres med HR-SD-oktober for å demonstrere at injeksjon ligger mellom riktig lagene av netthinnen (dvs. subretinal plass). HR-SD-oktober kan også brukes til å avgrense umiddelbart mislykkede forsøk (kirurgiske feil) til å identifisere relevante variabler i ekte kirurgisk tid til å forbedre tilnærming. Vi fant at HR-SD-oktober gir mange fordeler i preklinisk gene terapi studier ved å tillate rask kvantitativ vurdering av ytre retinal degenerasjon, slik at ID/culling av studien dyr ikke oppfyller eksperimentelle kriterier ( f.eks feil subretinal injeksjon), og å direkte oppfølging imaging til regionen øyet der vektor ble levert (der prekliniske effekten er mest sannsynlig) samt kontrollere regioner der vektor ikke ble levert. Siden sin utvikling, bruk av SD-oktober har fortsatt å bli akseptert og brukes av Oftalmologi forskere regnes nå standarden på netthinnen bildebehandling i netthinnen vitenskapelige studier i mus eller gnager modeller13,25. HR-SD-oktober og programvare egenskaper ble benyttet i unike integrert måter å fremme vellykket kvantitativ genterapi musen modeller på hvert trinn i prosessen, inkludert dyremodell utvalg, karakterisering av degenerasjon i valgte mål sykdom modeller, terapeutiske levering, kartlegging vektor leveringsmåte og toksisitet/effekt evaluering. Bruk av HR-SD-oktober gir mer effektiv stoffet funnet på alle trinn i prosessen. Her beskriver vi disse fremgangsmåtene som brukes i RNA Drug Discovery programmet.
HR-SD-oktober gir en enkel metode for karakteristikk av potensielle dyr modeller for menneskelig sykdom å fastslå nytten i testing potensielle therapeutics. Muligheten til å raskt og pålitelig karakterisere en potensiell dyr modell for menneskelig sykdom er avgjørende for prosessen med terapeutisk medikament oppdagelse (f.eks, erstatning gene terapi, ribozyme eller shRNA knockdown genterapi, kombinert genterapi). HR-SD-oktober gir en enkel, rask og ikke-invasiv metode for å vurdere retinal helse som kan br…
The authors have nothing to disclose.
Dette materialet er basert på arbeid støttes, delvis av Institutt for Veteraner saker (VA), veteraner helse Administration, Office for forskning og utvikling (biomedisinsk laboratorium forskning og utvikling) (VA Merit Grant 1I01BX000669). JMS er ansatt, delvis som ansatte lege-forsker, Oftalmologi, VA WNY; Kalt MCB er ansatt, delvis av VA WNY. Studien ble utført på, og støttes delvis av veteraner administrasjon Western New York helse systemet (Buffalo, NY). Innholdet representerer ikke synspunktene til Department of Veterans Affairs eller myndighetene i USA. Støttes også, i stor del, ved NIH/NEI R01 gir EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 gi EY016662 (UB Vision infrastruktur Center, PI: M slakting, direktør – Biophotonics modul: JMS), en ubegrenset tilskudd til avdeling for Oftalmologi/Universitetet i Buffalo fra forskning til forhindre blindhet (New York, NY), og et stipend fra Oishei Foundation (Buffalo, NY). Vi erkjenner gave hC1 transgene RHOP347S linjen og ekson 1 musen RHO knockout fra Dr. Janis Lem (dusker New England Medical Center, Boston, MA), og gave NHR-E transgene modellen i heterozygote tilstand på den musen ekson 2 RHO knockout bakgrunn fra Dr. G. Jane Farrar og Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).
C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
N129R- | N/A | N/A | |
2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
Forceps | Milton | 18-825 | |
Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
Windows Excel | Microsoft | N/A | |
Adobe Illustrator | Adobe | ||
Scale | Mettler | ||
Scissors | World Precision Instruments | ||
Ear punch | Nat’l band | ||
CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
Heating plate | In House | N/A | |
Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
Contact lenses | In-house | N/A | |
Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |