Tomografía de coherencia óptica ultraalta resolución ratón para facilitar la inyección Intraocular en investigación de retina la terapia génica
Summary
Aquí nos muestran un nuevo enfoque al uso de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral de alta resolución (HR-SD-OCT) para facilitar la presentación de los agentes de terapia génica en el espacio subretinal, evaluar su cobertura areal y caracterizan la vitalidad del fotorreceptor.
Abstract
HR-SD-OCT se utiliza para monitorizar la progresión de la degeneración de fotorreceptores en modelos de ratón vivo, evaluar la prestación de agentes terapéuticos en el espacio subretinal y para evaluar la toxicidad y la eficacia en vivo. HR-SD-OCT utiliza cerca de luz infrarroja (800-880 nm) y tiene óptica específicamente diseñado para la única óptica del ojo de ratón con una resolución axial de sub-2 micrones. Fueron imágenes de modelos de ratón transgénico de degeneración retiniana externa (fotorreceptor) y controles para evaluar la progresión de la enfermedad. Vidrio tirado microneedles fueron utilizados para entregar inyecciones retiniana sub de virus adeno-asociado (AAV) o nanopartículas (NP) a través de un enfoque trans-escleral y trans-coroides. Cuidadosa colocación de la aguja en el espacio subretinal fue requerida antes de una inyección de presión calibrada, que entrega el líquido en el espacio retiniano sub. Se realizó cirugía subretinal en tiempo real en nuestra retina imágenes de sistema (RIS). HR-SD-OCT demostró degeneración progresiva de retina uniforme debido a la expresión de una tóxico rodopsina mutante humana mutante (P347S) (RHOP347S) transgénica en ratones. HR-SD-OCT permite cuantificación rigurosa de todas las capas retinianas. Capa nuclear externa (ONL) grueso y fotorreceptores segmento externo (OSL) las mediciones de longitud se correlacionan con la vitalidad del fotorreceptor, degeneración o rescate. El sistema RIS permite la visualización en tiempo real de inyección subretinal en neonatal (~ P10-14) o ratones adultos, HR-SD-OCT inmediatamente determina el éxito de la entrega y mapas de extensión areal. HR-SD-OCT es una herramienta poderosa que puede evaluar el éxito de la cirugía subretinal en ratones, además para medir la vitalidad de fotorreceptores en vivo. HR-SD-OCT puede utilizarse también para identificar cohortes animal uniforme para evaluar el grado de degeneración retiniana, toxicidad y rescate terapéutico en estudios de investigación de terapia génica preclínica.
Introduction
Los investigadores están desarrollando terapias genéticas para una variedad de enfermedades degenerativas retinianas y retinales con la esperanza de traducir novela terapéutica en tratamientos para la enfermedad humana1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. dominio del tiempo o la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) se ha utilizado para investigar los aspectos de la degeneración retiniana externa en modelos de ratón específicos de enfermedad12,13,14 . HR-SD-OCT sin embargo, no ha sido ampliamente utilizado en el contexto de optimización de la evaluación de modelos de ratón para determinar la velocidad y uniformidad espacial de degeneración retiniana, o en el contexto de la evaluación preclínica de gene base terapéutica, por ejemplo, a evaluar el rescate, la toxicidad o la extensión espacial del vector entrega8,15,16. Una vez que un modelo de ratón es caracterizado completamente, los datos de HR-SD-OCT pueden servir como recurso informativo y confiable para medir el impacto de la terapéutica para ejercer el rescate o toxicidad en modelos de ratón de la degeneración retiniana17. Muchos grupos utilizan inyección subretinal como un método de entrega de vectores debido a su eficiencia en la transducción de fotorreceptores y células del epitelio (RPE) del pigmento retiniano. Sin embargo, esto sigue siendo un método difícil de dominar, dado que normalmente se hace por cirugía de la mano libre de la superficie corneal y a menudo está llena de cataratas, hemorragias y desprendimientos de retina no deseados que ocurren simplemente por la manipulación de la parte posterior vítrea. Muchos grupos todavía intentar subretinales inyecciones ciegas y entregan el virus usando inyecciones manuales con diámetro relativamente grande acero inoxidable agujas (34G)8,17,18,19 ,20,21,22y tomografía de coherencia óptica utiliza unos (OCT) la proyección de imagen para confirmar la correcta entrega de vector a la retina8,17, 20 , 22. algunas mejoras en el método se han descrito recientemente con agujas de microescala impulsadas por un micromanipulador22.
Presentamos un enfoque integrado que ayuda en la colocación de la aguja, y las inyecciones son facilitadas por un oftalmoscopio estéreo dirigido personalizado diseñado en el laboratorio para visualizar dentro del pequeño ojo de ratón17, 23. el uso de agujas micro vidrio tirado junto con el micromanipulador estereotáxicas proporcionan mejor control de la colocación de la aguja con ningún corte quirúrgico requerido (es decir, a través de conjuntiva y tejido conectivo) antes inyección. Inyector micro ayuda a entregar volúmenes de inyección constante de regular el uso de la presión y la inyección se puede hacer con mayor estabilidad, precisión y mucho más lenta que las inyecciones manual realizadas por una jeringa de mano, lo que disminuye la ocurrencia de inyección de burbuja en el ojo. La aguja más pequeña ayuda a prevenir fugas después del retiro de la aguja porque la ruta es autosellante. Para evaluar el grado de inyección/entrega, muchos grupos de investigación dependen de encontrar y evaluar la extensión areal de expresión de la proteína (EGFP) de mayor fluorescencia verde en la retina (construcción de la expresión por el vector) en el extremo experimental punto (eutanasia) para confirmar éxito inyecciones11,19,20,24. Este enfoque (no utilizando OCT) para verificar el éxito quirúrgico desperdicia una enorme cantidad de recursos en tiempo de procedimiento quirúrgico y los animales, ya que todos los animales con fracasos quirúrgicos (desconocidos) necesitan mantenimiento, con medidas repetitivas hasta eutanasia y el ojo de la cosecha (cuando se mide la EGFP). Confirmación de la localización de la inyección en la retina puede mejorarse usando HR-SD-OCT para demostrar que la inyección se encuentra entre las capas correcto de la retina (es decir, el espacio subretinal). HR-SD-OCT puede utilizarse también para delinear inmediatamente intentos (fracasos quirúrgicos) para identificar las variables relevantes en tiempo real quirúrgico para mejorar el enfoque. Encontramos que HR-SD-OCT proporciona numerosas ventajas en preclínica gene estudios de terapia permitiendo rápida evaluación cuantitativa de la degeneración retiniana externa, que permite la identificación/sacrificio de los animales de estudio que no cumplen criterios experimentales ( por ejemplo, inyección subretinal incorrecta) y a dirigir la proyección de imagen de seguimiento a la región del ojo donde vector fue entregado (donde es más probable el efecto preclínico) como controlar regiones donde vector no fue entregado. Desde su desarrollo, el uso de la SD-OCT ha continuado ser aceptada y utilizada por los investigadores de Oftalmología y ahora se considera el estándar de la proyección de imagen retiniana en retinales estudios científicos en ratón o roedor modelos13,25. HR-SD-OCT y sus capacidades de software fueron utilizados en formas únicas integradas a la meta éxito cuantitativo de terapia del gene en modelos de ratón en cada paso en el proceso, incluyendo la selección del modelo animal, caracterización de la degeneración en elegido modelos de la enfermedad, terapéutica entrega, asignación de vectores de entrega y evaluación de toxicidad/eficacia. El uso de recursos humanos-SD-OCT permite el descubrimiento de fármacos más eficiente en todos los niveles del proceso. Aquí describimos los enfoques que se utilizan en nuestro programa de descubrimiento de fármacos ARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
HR-SD-OCT proporciona un método simple para la caracterización de potenciales modelos animales de enfermedad en humanos para determinar su utilidad en la prueba terapéutica potencial. La capacidad de rapidez y fiabilidad caracterizar un modelo animal potencial de la enfermedad humana es fundamental para el proceso de descubrimiento de drogas terapéuticas (p. ej., terapia de recambio genética, terapia del gene precipitación ribozyme o shRNA, terapia génica combinada). HR-SD-OCT proporciona un método simpl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material está basado en trabajo apoyado, en parte, por el Departamento de Asuntos Veteranos (VA), Veterans Health Administration, oficina de investigación y desarrollo (Biomédica de laboratorio de investigación y desarrollo) (beca de mérito VA 1I01BX000669). JMS es empleado, en parte, como personal médico-científico, oftalmología, de por qué VA; MCB es empleado, en parte, de por qué VA. El estudio fue llevado a cabo en y apoyado en parte por el sistema sanitario veteranos administración occidental Nueva York (Buffalo, NY). Contenidos no representan las opiniones del Departamento de asuntos de veteranos o el gobierno de Estados Unidos. También apoyó, en gran parte, por NEI/NIH R01 grant EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 conceder EY016662 (UB visión infraestructura centro, PI: M sacrificio, Director – biofotónica módulo: JMS), un subsidio sin restricciones a la Departamento de Oftalmología/Universidad Búfalo de la investigación para evitar la ceguera (Nueva York) y una beca de la Fundación de Oishei (Buffalo, NY). Reconocemos el don de la líneaP347S de hC1 transgénica RHOy el ratón del exón 1 nocaut RHO de Dr. Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) y el regalo del modelo transgénico NHR-E en el estado heterozigótico en la ratón exón 2 RHO nocaut en el segundo plano de los Drs. G. Jane Farrar y Peter Humphries (Trinity College, Dublín, Irlanda).
Materials
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
Riferimenti
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