Tomographie à cohérence optique souris ultra haute résolution pour faciliter l’Injection intraoculaire dans la recherche de la thérapie génique rétinienne
Summary
Nous démontrons une nouvelle approche à l’utilisation de tomographie à cohérence optique domaine spectral haute résolution (HR-SD-OCT) pour aider l’administration d’agents de thérapie génique dans l’espace sous-rétinienne, évaluer sa couverture areal et caractériser la vitalité des photorécepteurs.
Abstract
HR-SD-OCT est utilisé pour surveiller la progression de la dégénérescence des photorécepteurs dans des modèles de souris vivante, évaluer l’administration d’agents thérapeutiques dans l’espace sous-rétinienne et d’évaluer la toxicité et l’efficacité le in vivo. HR-SD-OCT utilise près de lumière infrarouge (800-880 nm) et a l’optique spécialement conçu pour l’unique optique de le œil de souris avec résolution axiale sub-2-micron. Modèles de souris transgéniques de dégénérescence rétinienne externe (photorécepteurs) et les contrôles ont été imagées pour évaluer la progression de la maladie. Verre tiré des micro-aiguilles servaient à administrer des injections rétinienne de sup d’adeno-associated virus (AAV) ou de nanoparticules (NP) via une approche trans-sclérale et trans-choroïdienne. Attention, positionnement de l’aiguille dans l’espace sous-rétinienne était nécessaire avant une injection pression calibrée, qui délivre le fluide dans l’espace rétinienne sub. Temps réel sous-rétinienne chirurgie a été réalisée sur notre rétine imaging system (RIS). HR-SD-OCT a démontré la dégénérescence rétinienne progressive uniforme en raison de l’expression d’un humain mutant mutante rhodopsine toxique (P347S) transgène (RHOP347S) chez la souris. HR-SD-OCT permet une quantification rigoureuse de toutes les couches des rétiniens. Couche nucléaire externe (ONL) épaisseur et photorécepteur segment externe (OSL) mesures de longueur sont corrélés avec la vitalité des photorécepteurs, dégénérescence ou de sauvetage. Le système de largage RIS permet une visualisation en temps réel des injections sous-rétinienne dans néonatale (~ P10-14) ou de souris adultes et HR-SD-OCT immédiatement détermine le succès de la livraison et cartes étendue aréale. HR-SD-OCT est un outil puissant capable d’évaluer le succès de la chirurgie sous-rétinienne chez la souris, en outre de mesurer la vitalité des photorécepteurs in vivo. HR-SD-OCT permet également d’identifier des cohortes animales uniformes pour évaluer le degré de dégénérescence rétinienne, la toxicité et sauvetage thérapeutique dans des études de recherche de thérapie génique préclinique.
Introduction
Chercheurs mettent au point des thérapies géniques pour une variété de maladies dégénératives rétiniennes et rétiniennes dans l’espoir de traduire les nouvelles thérapeutiques en traitements pour les maladies humaines1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. domaine temporel ou tomographie en cohérence optique domaine spectral (SD-OCT) a été utilisée pour étudier les aspects de la dégénérescence rétinienne externe dans des modèles de souris spécifiques de maladie12,13,14 . HR-SD-OCT n’a pas, toutefois, été largement utilisé dans le contexte de l’optimisation évaluation de modèles murins pour déterminer le taux et l’uniformité spatiale de dégénérescence rétinienne, ou dans le cadre de l’évaluation préclinique du gène basé thérapeutique, par exemple, à évaluer le sauvetage, la toxicité ou l’étendue spatiale de vecteur livraison8,15,16. Une fois un modèle de souris est entièrement caractérisé, les données RH-SD-OCT peuvent servir comme une ressource informative et fiable pour mesurer l’impact de la thérapeutique à exercer de sauvetage ou toxicité dans des modèles murins de la dégénérescence rétinienne,17. Plusieurs groupes utilisent injection sous-rétinienne comme méthode de livraison de vecteur en raison de son efficacité à transduction des photorécepteurs et les cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien. Toutefois, cela reste une méthode difficile à maîtriser, étant donné qu’il est généralement fait en chirurgie de la main-libre de la surface de la cornée et pose souvent des cataractes, des saignements et des décollements de la rétine involontaires qui se produisent par simple manipulation de la partie postérieure vitrifiée. Beaucoup de groupes encore tente des injections sous-rétinienne aveuglément et livrer le virus en utilisant des injections manuelles avec relativement de grand diamètre en acier inoxydable aiguilles (34G)8,17,18,19 ,20,21,22et quelques usages tomographie par cohérence optique (OCT) imagerie pour confirmer la livraison appropriée de vecteur à la rétine8,17, 20 , 22. quelques améliorations dans la méthode ont été récemment décrites à l’aide d’aiguilles microscale pilotées par un micromanipulateur22.
Nous présentons une approche intégrée qui facilite le positionnement de l’aiguille, et les injections sont facilitées par un ophtalmoscope stéréo dirigé personnalisé, conçu en laboratoire spécialement pour visualiser l’intérieur de le œil petit des souris17, 23. l’utilisation d’aiguilles micro verre tiré en conjonction avec le micromanipulateur stéréotaxique fournissent un meilleur contrôle du placement de l’aiguille avec aucune chirurgie coupé requis (c.-à-d., à travers la conjonctive et du tissu conjonctif) avant injection. L’utilisation de la pression régulée volumes d’injection cohérente d’injecteur micro contribue à livrer, et l’injection peut être faite avec la plus grande stabilité, précision et beaucoup plus lente que les injections manuelles effectuées par une seringue à main, réduisant ainsi la apparition de l’injection de bulles dans le œil. La plus petite aiguille permet d’éviter les fuites après retrait de l’aiguille, car le chemin est hermétique. Pour évaluer l’ampleur de l’injection/livraison, plusieurs groupes d’enquête dépendent de trouver et d’évaluer l’étendue de l’expression de protéines (EGFP) fluorescence verte améliorée dans la rétine (construction d’expression envoyée par le vecteur) à la fin expérimentale pour confirmer les injections réussies11,19,20,24, point (euthanasie). Cette approche (ne pas en utilisant OCT) pour vérifier la réussite chirurgicale gaspille une énorme quantité de ressources temps procédure chirurgicale et des animaux, puisque tous les animaux avec des échecs chirurgicaux (inconnus) doivent être maintenus, a suivi avec des mesures répétées jusqu’à ce que euthanasie et oeil de récolte (lorsque EGFP est mesurée). Confirmation de l’emplacement de l’injection dans la rétine peut être améliorée à l’aide de HR-SD-OCT pour démontrer que l’injection est située entre les couches correctes de la rétine (c’est-à-dire l’espace sous-rétinienne). HR-SD-OCT peut également être utilisé pour délimiter immédiatement les tentatives infructueuses (échecs chirurgicaux) pour déterminer les variables pertinentes en temps réel chirurgical afin d’améliorer l’approche. Nous avons trouvé que HR-SD-OCT offre nombreux avantages gène précliniques études de thérapie en autorisant rapide évaluation quantitative de la dégénérescence rétinienne externe, permettant l’identification/abattage d’animaux, étude qui ne répondent pas aux critères expérimentaux ( par exemple, injection sous-rétinienne incorrecte) et à direct suivi d’imagerie pour la région de le œil où vecteur a été livré (effet préclinique étant probablement) ainsi que le contrôle des régions où vecteur n’a pas remis. Depuis son développement, l’utilisation du SD-OCT a continué à être accepté et utilisé par les chercheurs de l’ophtalmologie et est aujourd’hui considérée comme la norme d’imagerie rétinienne dans des études scientifiques rétiniens de souris ou les rongeurs modèles13,25. HR-SD-OCT et ses capacités de logiciels ont été utilisées de manière intégrée unique pour atteindre son objectif de réussite quantitative génothérapie dans des modèles murins à chaque étape du processus, y compris la sélection de modèle animal, caractérisation de la dégénérescence dans choisie les modèles de maladies, livraison thérapeutique, cartographie des prestation de vecteur et l’évaluation de la toxicité/efficacité. L’utilisation des ressources humaines-SD-OCT permet la découverte de médicaments plus efficace à tous les niveaux du processus. Nous décrivons ici ces approches utilisées dans notre programme de découverte de médicaments de l’ARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
HR-SD-OCT fournit une méthode simple pour la caractérisation des modèles animaux de maladies humaines afin de déterminer leur utilité dans l’essai thérapeutique possible. La capacité de rapidement et sûrement caractériser un modèle animal de la maladie humaine est essentielle pour le processus de découverte de médicaments thérapeutiques (par exemple, thérapie de remplacement de gène, ribozyme ou shARN défiant thérapie génique, la thérapie génique combinée). HR-SD-OCT fournit une méthode s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce matériel est basé sur le travail soutenu, en partie, par le ministère des anciens combattants (VA), le Veterans Health Administration, le Bureau de recherche et le développement (laboratoire de recherche biomédicale et le développement) (Bourse de mérite VA 1I01BX000669). JMS travaille, en partie, comme médecin-chercheur, ophtalmologie, VA WNY ; MCB est employé, en partie, par VA WNY. L’étude a été menée à et financée en partie par le système de santé des anciens combattants Administration Western New York (Buffalo, NY). Contenu ne représente pas les vues du ministère des anciens combattants ou le gouvernement des États-Unis. Également pris en charge, en majeure partie, par le NIH/NEI R01 grant EY013433 (PI : JMS), NIH/NEI R24 accorder EY016662 (UB Vision Infrastructure Center, PI : M abattage, directeur – biophotonique Module : JMS), une subvention sans restriction pour le département d’ophtalmologie/Université à Buffalo de la recherche pour prévenir la cécité (New York, NY) et une subvention de la Fondation Oishei (Buffalo, NY). Nous reconnaissons le don de la lignée transgénique desP347S RHOhC1 et la souris de l’exon 1 knockout RHO de Dr Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) et le don du transgène modèle NHR-E à l’état hétérozygote sur le la souris exon 2 RHO knockout fond de Drs G. Jane Farrar et Peter Humphries (Trinity College, Dublin, Irlande).
Materials
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
Riferimenti
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