כאן אנחנו מדגימים גישה מוזרה לשימוש טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי ברזולוציה גבוהה (HR-SD-אוקטובר) כדי לסייע משלוח של סוכנים טיפול גנטי לחלל subretinal להעריך את פעולתה אמיתיות, לאפיין את קולט אור חיוניות.
HR-SD-אוקטובר מנוצל כדי לעקוב אחר ההתקדמות של ניוון קולט אור במודלים של העכבר בשידור חי, להעריך את המסירה של סוכני טיפולית לחלל subretinal, וכן להעריך רעילות והיעילות ויוו. HR-SD-אוקטובר משתמשת ליד אור אינפרא-אדום (800-880 ננומטר) ויש אופטיקה במיוחד המיועד של אופטיקה ייחודי של העין העכבר עם רזולוציה צירית sub-2-מיקרון. העכבר הטרנסגניים מודלים של ניוון הרשתית החיצונית (קולט אור) ופקדים היו עם תמונה כדי להעריך את התקדמות המחלה. Microneedles זכוכית משך שימשו כדי לספק זריקות ברשתית sub של adeno-הקשורים וירוס (AAV) או חלקיקים (NP) דרך בגישה טרנס-scleral, טרנס-חיבור. מיצוב זהיר של המחט לתוך מרחב subretinal נדרשה לפני זריקה מכויל ללחץ, אשר מספק נוזלים לחלל תת ברשתית. ניתוח subretinal בזמן אמת נערך על הרשתית שלנו מערכת (RIS) הדמיה. HR-SD-אוקטובר הפגינו מתקדמת ניוון הרשתית אחיד עקב ביטוי רעילים מוטציה האנושי מוטציה אופסין # רודופסין (P347S) transgene (RHOP347S) בעכברים. HR-SD-OCT מאפשר כימות קפדני של כל השכבות ברשתית. השכבה החיצונית גרעינית (גרת) בעובי ואת קולט אור מדידות אורך (OSL) קטע החיצוני לתאם עם קולט אור חיוניות, ניוון או הצלה. מערכת משלוח RIS מאפשר הדמיה בזמן אמת של זריקות subretinal במחלקת יולדות (~ P10-14) או עכברים בוגרים, ו- HR-SD-אוקטובר מיד קובע ההצלחה של משלוח ומפות המכסים איזורים. HR-SD-אוקטובר הוא כלי רב עוצמה שיכול להעריך את ההצלחה של הניתוח subretinal בעכברים, בנוסף כדי מדידה החיוניות photoreceptors vivo בתוך. HR-SD-אוקטובר יכול לשמש גם כדי לזהות אחיד גדודים בעלי חיים כדי להעריך את היקף ניוון הרשתית, רעילות, והצלה טיפולית בתוך הגן פרה טיפול מחקרים.
חוקרים מפתחים ג’ין טיפולים למגוון רחב של מחלות ניוון רשתית ברשתית עם התקוות של הריפוי לתרגם טיפולים עבור מחלות אנושיות1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. ובזמן תחום או תחום ספקטרלי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (SD-אוקטובר) נעשה שימוש כדי לחקור את ההיבטים של ניוון הרשתית החיצונית במודלים של העכבר ספציפיים של המחלה12,13,14 . HR-SD-אוקטובר לא, לעומת זאת, היה נרחב בשימוש בהקשר של אופטימיזציה של הערכה של מודלים העכבר כדי לקבוע את שיעור ואחידות המרחבי של ניוון הרשתית, או בהקשר של הערכת פרה ג’ין מבוסס הרפוי, לדוגמה, ל להעריך הצלה, רעילות או להיקף המרחבי של וקטור משלוח8,15,16. פעם דוגמנית העכבר מאופיין באופן מלא, הנתונים HR-SD-אוקטובר יכול לשמש משאב מקיף ואמין כדי למדוד את ההשפעה של הרפוי להפעיל חילוץ או רעילות במודלים של העכבר של ניוון הרשתית17. קבוצות רבות משתמשים הזרקת subretinal כשיטה של וקטור משלוח בשל היעילות שלה-transducing photoreceptors, תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית. עם זאת, זה עדיין שיטה קשה להתמחות, בהתחשב בכך שזה נעשית בדרך כלל על ידי ניתוח סגנון חופשי ממשטח הקרנית, כרוך לעיתים קרובות עם קטרקט, דימום, לא מכוונות detachments ברשתית מתרחשים על-ידי מניפולציה של הצד האחורי בזגוגית. קבוצות רבות עדיין ניסיון זריקות subretinal בצורה עיוורת ולספק את הווירוס באמצעות זריקות ידנית עם קוטר גדול יחסית פלדת אל-חלד מחטים (34 גר’)8,17,18,19 ,20,21,22, ואת מספר שימושים טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) הדמיה כדי לאשר מסירה נכונה של וקטור רשתית8,17, 20 , 22. כמה שיפורים בשיטה לאחרונה תוארו באמצעות מחטים microscale מונע על ידי micromanipulator22.
אנו מציגים גישה אינטגרטיבית אשר מסייע מיקום המחט, הזריקות הן בהנחייתם של ophthalmoscope מותאם אישית סטריאו מכוונת תוכנן במעבדה במיוחד להמחשת בתוך העין קטן של העכבר17, 23. השימוש זכוכית משך מחטים מיקרו בשיתוף עם micromanipulator stereotaxic לספק שליטה טובה יותר של מיקום המחט ללא חיתוך כירורגי למטה נדרש (קרי, דרך conjunctivae, רקמת חיבור) לפני זריקה. השימוש של הלחץ מוסדר מזרק מיקרו מסייע לספק הזרקת עקבי אמצעי אחסון ולאחר הזרקת יכול להיעשות עם יציבות גדול בהרבה, דיוק, איטית יותר מאשר זריקות ידנית המבוצעת על ידי מזרק ידניים, ובכך להקטין מופע של הזרקת קצף לתוך העין. המחט קטן עוזר למנוע את זליגת בעקבות הנסיגה המחט שהנתיב אינו עצמית איטום. כדי להעריך את היקף הזרקה/מסירה, קבוצות חקירה רבות להסתמך על מציאת הערכת מידת אמיתיות פלורסצנטיות ירוק משופרת ביטוי חלבון (EGFP) ברשתית (לבנות ביטוי מועברים על ידי וקטור) בסוף ניסיוני הצבע (המתת חסד) כדי לאשר זריקות מוצלחות11,19,20,24. זה מתקרב (אינו מנצל OCT) כדי לוודא הצלחה ניתוחי מבזבז כמות עצומה של משאבים בעלי חיים, ושעת פרוצדורלי כירורגי מאז כל החיות עם כשלים כירורגי (לא ידוע) צריך להיות מתוחזק, ואחריו עם מידות החוזרות על עצמן עד המתת חסד ועין הקציר (כאשר EGFP נמדדת). אישור על המיקום של הזרקת ברשתית ניתן לשפר באמצעות HR-SD-OCT כדי להדגים כי הזרקת ממוקם בין שכבות הנכון של הרשתית (כלומר החלל subretinal). HR-SD-אוקטובר יכול לשמש גם כדי מיד ניסחו נסיונות כושלים (כישלונות כירורגי) לזהות את המשתנים הרלוונטיים בזמן אמיתי כירורגית כדי לשפר את הגישה. מצאנו כי HR-SD-אוקטובר מספק יתרונות רבים בגן פרה לימודי טיפול על-ידי מתן ראפיד הערכה כמותית של ניוון הרשתית החיצונית, המאפשר זיהוי/ליקוט של מחקר בבעלי חיים אשר אינם עומדים בקריטריונים ניסיוני ( למשל, הזרקת subretinal שגוי), וכדי לכוון ומעקב הדמיה לאזור העין איפה וקטור נמסרה (אפקט פרה איפה הכי סביר), כמו גם לשלוט אזורים שבהם לא נמסרה וקטור. מאז התפתחותו, השימוש SD-אוקטובר המשיכה להיות מקובלים, משמשים חוקרים אופתלמולוגיה ונחשב כיום התקן של הדמיה ברשתית במחקרים מדעיים רשתית העכבר או מכרסם מודלים13,25. HR-SD-אוקטובר ויכולות התוכנה שלה נוצלו בדרכים משולב ייחודי כדי לקדם את המטרה של ריפוי גנטי כמותי מוצלחת במודלים של העכבר בכל שלב בתהליך, כולל הבחירה במודל חיה, אפיון מנוון הנבחר מחלת מודלים, משלוח טיפולית, מיפוי של וקטור משלוח והערכה רעילות/יעילות. השימוש של HR-SD-OCT מאפשר גילוי התרופה יעילה יותר בכל רמה של התהליך. כאן נתאר גישות אלה המשמשים בתוכנית שלנו גילוי תרופות ה-RNA.
HR-SD-אוקטובר מספק שיטה פשוטה פלואורסנציה פוטנציאליים מודלים חייתיים של מחלות אנושיות כדי לקבוע את התועלת שלהם בבדיקת פוטנציאל הרפוי. היכולת לאפיין במהירות ובאמינות מודל בעלי פוטנציאל של מחלות אנושיות חיוני לתהליך של גילוי תרופות טיפוליות (למשל, ריפוי גנטי חלופי, ריפוי גנטי תמונות צי?…
The authors have nothing to disclose.
חומר זה מתבסס על עבודה נתמכת, בחלקו, על-ידי המחלקה של ותיקי פרשיות (וי אי), בריאות למינהלה, Office של מחקר ופיתוח (מחקר מעבדה ביו ופיתוח) (מענק הצטיינות VA 1I01BX000669). JMS מועסק, בחלקו, כמו צוות רופא-מדען, רפואת עיניים, על-ידי VA יורד; MCB הוא מועסק, בין השאר, על ידי VA יורד. המחקר שנערך, והוא נתמך בחלקה על ידי, ותיקי המינהל ווסטרן ניו יורק בריאות המערכת (באפלו, ניו יורק). תוכן אינם מייצגים את נופי המחלקה לענייני חיילים משוחררים או ממשלת ארצות הברית. גם נתמך, בחלק גדול, על-ידי NIH/NEI R01 הענק EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 להעניק EY016662 (UB חזון תשתית מרכז, PI: מ’ שחיטה, מנהלת מודול ביו-פוטוניקה: JMS), גרנט בלתי מוגבלת כדי המחלקה של רפואת עיניים/אוניברסיטת ב תאו מן המחקר כדי למנוע עיוורון (ניו יורק), ומענק של הקרן Oishei (באפלו, ניו יורק). אנו להכיר את המתנה של הקוP347S hC1 רוהטרנסגניים והעכבר אקסון 1 נוקאאוט רו מ ד ר לם ג’ניס (המרכז הרפואי טאפטס ניו אינגלנד, בוסטון) ולאחר המתנה של המודל transgene NHR-E במדינה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים על העכבר אקסון 2 רו נוקאאוט רקע של ד”ר ג. ג’יין פאראר ו פיטר המפריז (בטריניטי קולג ‘, דבלין, חמתו).
C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
N129R- | N/A | N/A | |
2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
Forceps | Milton | 18-825 | |
Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
Windows Excel | Microsoft | N/A | |
Adobe Illustrator | Adobe | ||
Scale | Mettler | ||
Scissors | World Precision Instruments | ||
Ear punch | Nat’l band | ||
CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
Heating plate | In House | N/A | |
Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
Contact lenses | In-house | N/A | |
Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |