Qui dimostriamo un nuovo approccio all’utilizzo di tomografia a coerenza ottica spectral-domain ad alta risoluzione (HR-SD-OCT) per assistere la consegna degli agenti di terapia genica nello spazio subretinal, valutare la sua copertura area e caratterizzano la vitalità del fotoricettore.
HR-SD-OCT è utilizzata per monitorare la progressione della degenerazione dei fotorecettori in modelli murini dal vivo, valutare la consegna degli agenti terapeutici nello spazio subretinal e per valutare la tossicità e l’efficacia in vivo. HR-SD-OCT utilizza nel vicino infrarosso (800-880 nm) e ha ottica specificamente progettato per l’unica ottica dell’occhio del mouse con risoluzione assiale sub-2 micron. Modelli murini transgenici di degenerazione retinica esterna (fotorecettori) e i controlli erano imaged per valutare la progressione di malattia. Vetro tirato microaghi erano usati per fornire sub retiniche iniezioni di virus adeno-associato (AAV) o nanoparticelle (NP) tramite un approccio trans-sclerale e trans-coroideale. Attento posizionamento dell’ago nello spazio subretinal è stato richiesto prima di un’iniezione di pressione calibrata, che trasporta il fluido nello spazio retinico sub. Tempo reale subretinal chirurgia è stato condotto su nostro retinica imaging system (RIS). HR-SD-OCT ha dimostrato la progressiva degenerazione retinica uniforme dovuto l’espressione di un tossico rodopsina mutante umano mutante (P347S) (RHOP347S) transgene in topi. HR-SD-OCT permette rigorosa quantificazione di tutti gli strati della retina. Strato nucleare esterno (ONL) del fotoricettore e spessore segmento esterno (OSL) misure di lunghezza si correlano con la vitalità dei fotorecettori, degenerazione o salvataggio. Il sistema di consegna RIS consente la visualizzazione in tempo reale delle iniezioni subretinal in neonatale (~ P10-14) o topi adulti e HR-SD-OCT immediatamente determina il successo di consegna e mappe estensione areale. HR-SD-OCT è un potente strumento che può valutare il successo della chirurgia subretinal in topi, inoltre a misurare la vitalità di fotorecettori in vivo. HR-SD-OCT consente anche di identificare coorti uniforme animale per valutare l’entità della degenerazione retinica, la tossicità e soccorso terapeutico in studi di ricerca di terapia genica preclinici.
I ricercatori stanno sviluppando terapie geniche per una varietà di malattie degenerative della retina e della retina con la speranza di tradurre approcci terapeutici in trattamenti per la malattia umana1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tempo dominio o tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) è stata utilizzata per indagare gli aspetti di degenerazione retinica esterna in modelli murini specifici di malattia12,13,14 . HR-SD-OCT non, tuttavia, è stato ampiamente utilizzato nel contesto della valutazione di modelli murini di ottimizzazione per determinare il tasso e l’omogeneità spaziale di degenerazione retinica, o nel contesto della valutazione preclinica di gene base terapeutica, ad esempio, a valutare l’estensione spaziale di vettore consegna8,15,16, tossicità o salvataggio. Una volta che un modello del topo è completamente caratterizzato, i dati di HR-SD-OCT possono servire come una risorsa informativa e affidabile per misurare l’impatto di terapeutica di esercitare tossicità in modelli murini di degenerazione retinica17o salvataggio. Molti gruppi sono tramite iniezione subretinal come metodo di consegna del vettore grazie alla sua efficienza alle transducing fotorecettori e cellule del pigmento retinico epitelio (RPE). Tuttavia, questo rimane un metodo difficile da padroneggiare, dato che essa viene in genere eseguita dalla chirurgia mano libera dalla superficie cornea e spesso è irto di cataratta, emorragia e le separazioni retiniche non intenzionali che accadono semplicemente tramite manipolazione del posteriore vitreo. Molti gruppi ancora tentano subretinal iniezioni ciecamente e consegnare il virus utilizzando iniezioni manuali con diametro relativamente grande in acciaio inox aghi (34G)8,17,18,19 ,20,21,22e alcuni usi tomografia a coerenza ottica (OCT) imaging per confermare la corretta consegna del vettore al retina8,17, 20 , 22. alcuni miglioramenti nel metodo recentemente sono state descritte usando gli aghi su microscala, guidati da un micromanipolatore22.
Vi presentiamo un approccio integrato che agevola il posizionamento dell’ago e le iniezioni sono facilitate da un oftalmoscopio stereo diretto personalizzato progettato in laboratorio specificamente per la visualizzazione all’interno dell’occhio piccolo del mouse17, 23. l’uso di micro aghi di vetro tirato in combinazione con il micromanipolatore stereotassiche forniscono un miglior controllo del posizionamento dell’ago con alcun taglio chirurgico giù richiesto (vale a dire, attraverso la congiuntiva e del tessuto connettivo) prima di iniezione. L’uso della pressione regolata iniettore micro aiuta a consegnare volumi di iniezione coerente, e l’iniezione può essere fatto con maggiore stabilità, precisione e molto più lenta di iniezioni manuali eseguite da una siringa portatile, diminuendo in tal modo la avvenimento di iniezione bolla nell’occhio. L’ago più piccolo aiuta a prevenire perdite dopo ritiro di ago perché il percorso è autosigillante. Per valutare la portata dell’iniezione/consegna, molti gruppi investigativi si basano sulla ricerca e la valutazione dell’estensione area di fluorescenza verde avanzata espressione della proteina (EGFP) nella retina (costrutto di espressione consegnato dal vettore) all’estremità sperimentale punto (eutanasia) per confermare il successo iniezioni11,19,20,24. Questo approccio (che non utilizzano OCT) per verificare il successo chirurgico rifiuti una quantità enorme di risorse in tempo chirurgico procedurale e gli animali, dato che tutti gli animali con guasti chirurgici (sconosciuti) devono essere mantenuti, seguita con misure ripetitive fino al eutanasia e occhio vendemmia (quando EGFP è misurata). Conferma della posizione di iniezione nella retina può essere migliorata utilizzando HR-SD-OCT per dimostrare che l’iniezione è situato tra gli strati corretti della retina (cioè lo spazio subretinal). HR-SD-OCT è utilizzabile anche per delineare immediatamente tentativi infruttuosi (guasti chirurgici) per identificare le variabili rilevanti in tempo reale chirurgico per migliorare l’approccio. Abbiamo trovato che HR-SD-OCT fornisce numerosi vantaggi nel gene preclinici terapia studi consentendo la rapida valutazione quantitativa della degenerazione retinica esterna, consentendo l’identificazione/abbattimento di animali di studio che non soddisfano i criteri sperimentali ( ad esempio, iniezione subretinal non corretto) e a dirigere la formazione immagine di follow-up nella regione dell’occhio dove il vettore è stato consegnato (dove è più probabile effetto preclinico) così come le aree dove non è stato recapitato vettoriale controlli. Dal suo sviluppo, l’uso di SD-OCT ha continuato ad essere accettati e utilizzati da ricercatori di oftalmologia ed è ora considerato lo standard di imaging retinico in studi scientifici retinici in mouse o roditore modelli13,25. HR-SD-OCT e le sue capacità di software sono stati utilizzati in modi unici integrati per portare avanti l’obiettivo di successo quantitativa di terapia genica in modelli murini in ogni fase del processo, tra cui selezione modello animale, caratterizzazione di degenerazione nella vostra modelli di malattia, consegna terapeutico, mappatura di consegna del vettore e la valutazione di efficacia/tossicità. L’uso di HR-SD-OCT permette per la scoperta di nuovi farmaci più efficiente ad ogni livello del processo. Qui descriviamo questi approcci che vengono utilizzati nel nostro programma di RNA Drug Discovery.
HR-SD-OCT fornisce un metodo semplice per la caratterizzazione dei potenziali modelli animali della malattia umana per determinare la loro utilità nella prova terapeutica potenziale. La capacità di rapido e affidabile caratterizzano un potenziale modello animale della malattia umana è fondamentale per il processo di scoperta della droga terapeutica (ad es., sostituzione terapia genica, la terapia genica atterramento ribozima o shRNA, terapia genica combinato). HR-SD-OCT fornisce un metodo semplice, rapido e n…
The authors have nothing to disclose.
Questo materiale si basa su lavori sostenuta, in parte, dal Department of Veterans Affairs (VA), Veterans Health Administration, ufficio di ricerca e sviluppo (laboratorio ricerca e sviluppo biomedico) (Grant Merit VA 1I01BX000669). JMS è impiegato, in parte, come il personale medico-scienziato, oftalmologia, da WNY VA; MCB è impiegato, in parte, da VA WNY. Lo studio è stato condotto presso e in parte supportato da, il sistema del Healthcare di New York di Veterans Administration Western (Buffalo, NY). Contenuti non rappresentano le opinioni di Department of Veterans Affairs o di governo degli Stati Uniti. Supportati anche, in gran parte, di NIH/nia R01 concedere EY013433 (PI: JMS), NIH/nia R24 concedere EY016662 (UB Vision infrastruttura Center, PI: M macellazione, direttore – biofotonica modulo: JMS), una sovvenzione illimitata per il dipartimento di Oftalmologia/Università presso Buffalo da ricerca per prevenire la cecità (New York, NY) e una sovvenzione dalla Fondazione Oishei (Buffalo, NY). Riconosciamo il dono di hC1 transgenici RHOP347S linea e il mouse dell’esone 1 RHO knockout da Dr. Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) e il dono del modello transgene NHR-E nella condizione eterozigotica sul esone 2 RHO knockout priorità bassa del mouse dalla d. ssa G. Jane Farrar e Peter Humphries (Trinity College, Dublino, IRE).
C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
N129R- | N/A | N/A | |
2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
Forceps | Milton | 18-825 | |
Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
Windows Excel | Microsoft | N/A | |
Adobe Illustrator | Adobe | ||
Scale | Mettler | ||
Scissors | World Precision Instruments | ||
Ear punch | Nat’l band | ||
CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
Heating plate | In House | N/A | |
Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
Contact lenses | In-house | N/A | |
Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |