超高解像度マウス光コヒーレンストモグラフィー網膜遺伝子治療研究における眼内注入を支援するために
Summary
網膜への遺伝子治療薬の配達をお手伝いし、その地域の範囲を評価する視細胞活力を特徴付ける高分解能スペクトル領域光干渉断層法 (HR-SD-OCT) を使用してへの新しいアプローチを示します。
Abstract
HR-SD-10 月は、ライブ マウス モデルにおける視細胞変性の進行を監視、下腔への治療薬の配達を評価と毒性と効果体内を評価するために活用されています。HR-SD-10 月近赤外光 (800-880 nm) を使用して、具体的には光学系を持ってサブミクロン 2 軸の解像度を持つマウス眼のユニークな光学系のために設計されています。病気の進行を評価するために外側の網膜 (視細胞) 変性およびコントロールのトランスジェニック マウス モデルをイメージしました。引っ張られたガラスのニードルは、強膜とトランス脈絡膜アプローチ アデノ随伴ウイルス (aav ベクター) または経由でナノ粒子 (NP) のサブ網膜注射を提供する使用されました。下腔に針の注意位置決めがサブ網膜領域に液体を提供する校正された圧力注入前に必要でした。私たちの網膜イメージング システム (RIS) リアルタイム網膜手術を行った。HR-SD-10 月実証、有害変異人間変異型ロドプシン (P347S) 式のための進歩的な制服網膜変性マウス (RHOP347S) 遺伝子。HR-SD-10 月では、すべての網膜の層の厳密な定量化をことができます。感光体活力、変性、または救助と相関する核外層 (ONL) 厚さと視細胞外側セグメントの長さ (OSL) 測定。RIS 納品システムにより新生児に、網膜下注射のリアルタイム可視化 (~ P10 14) つまりアダルト マウス、および HR SD-10 月配信の成功を決定する地域範囲をマップし、すぐに。HR-SD-OCT は、光受容体の生体の活力を測定するさらにマウスの網膜の手術の成功を評価する強力なツールです。HR SD OCT は、網膜変性、毒性、および前臨床遺伝子治療研究で治療救助の程度を評価する制服動物コホートを識別するために使用もできます。
Introduction
人間の病気1,2,3,4の治療法治療薬に翻訳を期待して様々 な網膜と網膜変性疾患に対する遺伝子治療を開発している研究者,5,6,7,8,9,10,11. 時間領域またはスペクトル領域光干渉断層法 (SD-10 月) は、外側の網膜変性疾患12,13,14 の特定のマウス ・ モデルでの側面を調査する使用されています.HR-SD-10 月、しかし、されていない広範囲率と網膜変性の空間的一様性を決定するマウス モデルの評価を最適化するコンテキストで使用や遺伝子の前臨床評価のコンテキスト ベースなどの治療に救助、毒性、またはベクトル配信8,15,16の空間範囲を評価します。マウス モデルは完全に特徴と、一度 10 月 HR-SD データは救助や網膜変性17のマウス ・ モデルにおける毒性を発揮する治療薬の影響を測定する有益で信頼性の高いリソースとして使用できます。多くのグループは、その視細胞と網膜色素上皮 (RPE) 細胞の伝達効率のためベクトル配信の方法として網膜注入を使用しています。しかし、これはマスターに難しい方法のまま角膜表面から無料手の外科によって通常行われますそれは多くの場合白内障、出血、および単に後方の操作によって発生する意図しない網膜剥離に満ちていることを考える硝子体。多くのグループはまだ盲目的に網膜の注射を試みるし、比較的大径ステンレス針 (34 G)8,17,と18,19 手動の注射を使用してウイルスを提供 ,20,21,22、およびいくつかを使用して光干渉断層計 (OCT) 網膜8,17,にベクトルの適切な配信を確認するイメージング20,22。 メソッドにいくつかの改善に最近マイクロマニピュレーター22によって駆動されるマイクロ針を使用して記載されています。
針の位置で支援する統合的なアプローチを提案して注射は、特にマウス17,の小さな眼の中を可視化するラボで設計されたカスタム監督ステレオ検眼鏡によって促進されます。23. 固定装置用マイクロマニピュレーターと共に引っ張られたガラス マイクロ針の使用前に必要な (すなわち、白い部分結膜と結合組織を通じて) ダウンないメスを入れると針の配置のよりよい制御を提供します。インジェクション。圧力の使用規制マイクロ インジェクターにより配信一貫した注入量とはるかに大きい安定性、精度と比べると手持ちの注射器、減らすによって実行される手動の注射で注入を行うことができます、目に気泡注入が発生します。小さい針は、針撤退次のパスはセルフシール漏れを防ぐのに役立ちます。注入/配信の程度を評価するために多くの調査グループで検索と実験の終わりに網膜 (表現の構成要素がベクターで配信) で強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 式の面積範囲を評価するのに頼る(安楽死) をポイントすると、成功した注射11,19,20,24を確認します。これは、アプローチは、(10 月を利用していない) (不明) の手術失敗ですべての動物がまで反復的な措置に続いて、維持する必要があるので手術の手続き時間と動物、廃棄物資源の膨大な量の手術の成功を確認するには安楽死と目収穫 (EGFP を測定) する場合。網膜の注入の場所の確認は、注射が網膜 (すなわち下腔) の正しい層の間に位置することを示すに HR SD-10 月を使用して改善できます。HR-SD-10 月は、すぐにアプローチを改良する実際の手術時間で関連する変数を識別する (外科的障害) の不成功な試みを記述する使用できます。我々 が見つかりました、HR SD-10 月臨床遺伝子の多数の利点療法研究によって提供外側の網膜変性症の急速な定量的評価実験条件 (を満たしていない研究動物の同定/殺処分を許可します。例えば、不適切な網膜注入)、ベクトルが配信されなかった地域をコントロールし同様、直接フォロー アップの観察 (臨床効果は最も可能性が高い) をベクトルが配信された目の領域にして。その開発以来 SD 10 月の使用を受け入れ、眼科研究者によって使用される続けています今マウスまたは齧歯動物モデル13,25で網膜の科学的研究で眼底イメージングの標準と考えられています。HR-SD-10 月とそのソフトウェア機能が動物モデルの選択、選択の変性の評価など、プロセスのあらゆる段階でマウス モデルで成功した量的遺伝子療法の目標を促進するためのユニークな統合された方法で活かされて疾患モデル、治療薬デリバリー、ベクトル配信、および毒性/有効性評価のマッピング。HR-SD-10 月より効率的な創薬プロセスのあらゆるレベルでの使用します。ここで私たちの RNA 創薬プログラムで使用されるこれらのアプローチについて述べる.
Protocol
Representative Results
Discussion
HR-SD-10 月は、潜在的な治療のテストでその有用性を決定する人間の病気の動物モデルの潜在的な特性のための簡単な方法を提供します。迅速かつ確実に人間の病気の動物モデルすることができる (例えば、代替遺伝子治療、リボザイムや shRNA ノックダウン遺伝子療法、複合遺伝子治療) の治療薬探索プロセスに不可欠です。HR-SD-10 月は、網膜の健康を特徴付けるし、ほぼすべてのマウ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この素材は、一部部門のベテラン出来事 (VA)、退役軍人健康庁、室の研究と開発 (生物医学研究および開発) によってサポートされる作業に基づいて (VA メリット助成金 1I01BX000669)。JMS に採用されての一部としてスタッフ医師・科学者、眼科、VA WNY;一部では、VA WNY に MCB を採用します。研究は、行われ、退役軍人管理ウエスタン ニューヨーク医療システム (ニューヨーク州バッファロー) によって一部にはサポートします。内容は、退役軍人局やアメリカ合衆国政府の見解を表していません。サポートも主要な部分は、NIH/ネイ R01 で付与 EY013433 (PI: JMS)、NIH/ネイ R24 付与 EY016662 (UB ビジョン インフラ センター、PI: M 虐殺、ディレクター-バイオフォトニクス モジュール: JMS)、無制限で与えるに部の眼科/大学で防ぐため失明 (ニューヨーク、ニューヨーク) に研究からバッファローと Oishei 財団 (ニューヨーク州バッファロー) からの助成金。我々 博士ジャニス ・ レム (タフツ ニュー イングランド医療センター, ボストン、マサチューセッツ) からローノックアウト、ヘテロ接合の状態で NHR E 遺伝子モデルのギフトには hC1 トランスジェニックローP347Sラインとエクソン 1 マウスのギフトを認める、マウス エクソン 2 RHOノックアウト背景夫妻 G. ジェーン ・ ファラーとピーター ・ ハンフリーズ (トリニティ ・ カレッジ、ダブリン、IRE) から。
Materials
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
Riferimenti
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