Aqui vamos demonstrar uma nova abordagem para usando a tomografia de coerência óptica espectral-domínio de alta resolução (HR-SD-OCT) para auxiliar entrega de agentes de terapia do gene para o espaço subretinal, avaliar sua cobertura areal e caracterizar vitalidade fotoreceptor.
HR-SD-OCT é utilizado para monitorar a progressão da degeneração fotorreceptoras em modelos do rato ao vivo, avaliar a entrega de agentes terapêuticos para o espaço subretinal e para avaliar a toxicidade e eficácia na vivo. HR-SD-OCT usa perto de luz infravermelha (800-880 nm) e tem ótica especificamente projetada para a única ótica do olho do rato com resolução axial mícron-sub-2. Modelos de rato transgénico da degeneração retiniana externa (fotorreceptor) e controles foram fotografados para avaliar a progressão da doença. Microagulhas puxado de vidro foram usadas para entregar sub retiniana injeções de vírus adeno-associado (AAV) ou nanopartículas (NP) através de uma abordagem trans-escleral e trans-coroide. Cuidado de posicionamento da agulha no espaço subretinal foi necessário antes uma injeção de pressão calibrado, que proporciona o fluido para o espaço da retina sub. Tempo real de cirurgia subretinal realizou-se na nossa imagem sistema (RIS) da retina. HR-SD-OCT demonstrou progressiva degeneração retinal uniforme devido a expressão de uma tóxica mutante humana mutante rodopsina (P347S) transgene (RHOP347S) em ratos. HR-SD-OCT permite a quantificação rigorosa de todas as camadas da retina. Medidas de comprimento (OSL) espessura e fotorreceptoras do segmento externo camada nuclear externa (ONL) correlacionam-se com vitalidade fotoreceptor, degeneração ou resgate. O sistema de entrega RIS permite a visualização em tempo real de injeções subretinal em neonatal (~ P10-14) ou ratos adultos e HR-SD-OCT imediatamente determina o sucesso de entrega e mapeia a extensão de areal. HR-SD-OCT é uma ferramenta poderosa que pode avaliar o sucesso da cirurgia subretinal em camundongos, além da vitalidade dos FOTORRECEPTORES em vivode medição. HR-SD-OCT também pode ser usado para identificar o uniformes coortes animais para avaliar o grau de degeneração da retina, toxicidade e resgate terapêutico em estudos de pesquisa de terapia de gene pré-clínicos.
Os investigadores estão a desenvolver terapias do gene para uma variedade de doenças degenerativas da retina e da retina com esperanças de traduzir novas terapêuticas em tratamentos para doenças humanas1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. no domínio do tempo ou a tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) tem sido usada para investigar os aspectos da degeneração da retina exterior em modelos do rato específico de doença12,13,14 . HR-SD-OCT não, no entanto, foi extensivamente usado no contexto da otimização de avaliação dos modelos de rato para determinar a taxa e a uniformidade espacial da degeneração da retina, ou no contexto da avaliação pré-clínica do gene com base terapêutica, por exemplo, a Avalie a extensão espacial do vetor entrega8,15,16, toxicidade ou resgate. Uma vez que um modelo do rato é caracterizado inteiramente, os dados de HR-SD-OCT podem servir como um recurso informativo e confiável para medir o impacto da terapêutica de exercer o resgate ou toxicidade em modelos do rato de degeneração da retina17. Muitos grupos estão usando injeção subretinal como um método de entrega de vetor devido a sua eficiência no transducing fotorreceptores e células do epitélio (RPE) pigmento da retina. No entanto, esta continua a ser um método difícil de dominar, dado que normalmente é feito por cirurgia mão livre da superfície da córnea e muitas vezes é repleta de catarata, sangramento e não intencionais destacamentos retinal ocorrem simplesmente por manipulação de posterior vítreo. Muitos grupos ainda tentam injeções subretinal cegamente e entregam o vírus usando injeções manuais com diâmetro relativamente grande aço inoxidável agulhas (34G)8,17,18,19 ,20,21,22e alguns usos óptico tomografia de coerência (OCT) para confirmar a entrega adequada de vetor para a retina8,17, de imagem 20 , 22. algumas melhorias no método recentemente têm sido descritas usando agulhas de microescala, impulsionadas por um micromanipulador22.
Apresentamos uma abordagem integrada que auxilia no posicionamento da agulha, e as injeções são facilitadas por um oftalmoscópio estéreo dirigido personalizado projetado no laboratório especificamente para visualização dentro do olho pequeno do rato17, 23. o uso de vidro puxado micro agulhas em conjunto com o micromanipulador estereotáxica fornecem melhor controle de colocação da agulha com nenhum corte cirúrgico para baixo necessária (ou seja, através da conjuntiva e do tecido conjuntivo) antes de injeção. O uso da pressão regulada injector micro ajuda entregar volumes de injeção consistente, e a injeção pode ser feita com muito maior estabilidade, precisão e muito mais lenta do que injeções manuais realizadas por uma seringa à mão, diminuindo assim o ocorrência de injeção de bolha no olho. A agulha menor ajuda a evitar vazamentos após a retirada da agulha, porque o caminho é auto-selante. Para avaliar a extensão da injeção/entrega, muitos grupos de investigação dependem de encontrar e avaliar a extensão de areal da expressão de proteínas (EGFP) fluorescência verde reforçada na retina (construção de expressão entregada pelo vetor) na extremidade experimental ponto (eutanásia) para confirmar o sucesso injeções11,19,20,24. Esta abordagem (não utilizando OCT) para verificar o sucesso cirúrgico desperdiça uma quantidade enorme de recursos em tempo de procedimento cirúrgico e animais, uma vez que todos os animais com falhas cirúrgicas (desconhecidos) precisam ser mantida, seguido com medidas repetitivas até colheita de eutanásia e olho (quando EGFP é medido). Confirmação do local da injeção na retina pode ser melhorada usando HR-SD-OCT para demonstrar que a injeção está localizada entre as camadas corretas da retina (ou seja, o espaço subretinal). HR-SD-OCT também pode ser usado para delinear imediatamente tentativas (falhas cirúrgicas) para identificar as variáveis relevantes em tempo real cirúrgico para aperfeiçoar a abordagem. Nós achamos que HR-SD-OCT fornece inúmeras vantagens no gene pré-clínicos estudos de terapia, permitindo rápida avaliação quantitativa da degeneração da retina exterior, permitindo a identificação/abate de animais de estudo que não cumpram critérios experimentais ( por exemplo, injeção subretinal incorreta) e para direcionar o follow-up de imagem para a região do olho, onde o vetor foi entregue (onde é mais provável efeito pré-clínicos), bem como controlar as regiões onde o vetor não foi entregue. Desde o seu desenvolvimento, o uso de SD-out tem continuado a ser aceito e utilizado pelos pesquisadores de Oftalmologia e agora é considerada o padrão de imagem da retina em estudos científicos da retina no rato ou roedor modelos13,25. HR-SD-OCT e seus recursos de software foram utilizados em maneiras originais de integrada para promover o objetivo da terapia bem sucedida gene quantitativa em modelos do rato em cada etapa do processo, incluindo a seleção de modelo animal, caracterização de degeneração no escolhido modelos de doença, entrega terapêutica, mapeamento de vetor entrega e avaliação de toxicidade/eficácia. O uso de HR SD-out permite a descoberta de medicamentos mais eficiente em todos os níveis do processo. Aqui descrevemos essas abordagens que são usadas em nosso programa de descoberta de drogas de RNA.
HR-SD-OCT fornece um método simples para a caracterização de potenciais modelos animais de doença humana para determinar sua utilidade na terapêutica potencial de teste. A capacidade de rapidamente e confiantemente caracterizam um potencial modelo animal de doença humana é fundamental para o processo de descoberta de drogas terapêuticas (por exemplo, terapia de substituição genética, terapia de gene “knockdown” ribozima ou shRNA, terapia genética combinada). HR-SD-OCT fornece um método simples, ráp…
The authors have nothing to disclose.
Este material é baseado em trabalho suportado, em parte, pelo departamento de assuntos de veteranos (VA), Veterans Health Administration, escritório de pesquisa e desenvolvimento (biomédica de laboratório de pesquisa e desenvolvimento) (VA mérito Grant 1I01BX000669). JMS é empregado, em parte, como pessoal médico-cientista, Oftalmologia, por VA porque; MCB é empregado, em parte, pela VA porque. O estudo foi realizado em e apoiado em parte, os veteranos administração Western New York Healthcare System (Buffalo, NY). Conteúdo não representam a opinião do departamento de assuntos de veteranos ou o governo dos Estados Unidos. Também apoiou, em grande parte, pelo NIH/NEI R01 conceder EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 conceder EY016662 (centro de infraestrutura de visão de UB, PI: M abate, diretor – Biophotonics módulo: JMS), uma concessão irrestrita para a departamento de Oftalmologia/Universidade Búfalo de investigação para evitar cegueira (Nova Iorque, NY) e uma bolsa da Fundação Oishei (Buffalo, NY). Reconhecemos o dom da linha deP347S de hC1 transgénica RHOe o mouse do exon 1 RHO nocaute do Dr. Janis Lem (centro médico de Tufts Nova Inglaterra, Boston, MA) e o dom do modelo no estado heterozigoto transgene NHR-E sobre o rato exon 2 RHO nocaute segundo plano de DRS G. Jane Farrar e Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).
C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
N129R- | N/A | N/A | |
2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
Forceps | Milton | 18-825 | |
Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
Windows Excel | Microsoft | N/A | |
Adobe Illustrator | Adobe | ||
Scale | Mettler | ||
Scissors | World Precision Instruments | ||
Ear punch | Nat’l band | ||
CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
Heating plate | In House | N/A | |
Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
Contact lenses | In-house | N/A | |
Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |