Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina
Summary
Aqui vamos demonstrar uma nova abordagem para usando a tomografia de coerência óptica espectral-domínio de alta resolução (HR-SD-OCT) para auxiliar entrega de agentes de terapia do gene para o espaço subretinal, avaliar sua cobertura areal e caracterizar vitalidade fotoreceptor.
Abstract
HR-SD-OCT é utilizado para monitorar a progressão da degeneração fotorreceptoras em modelos do rato ao vivo, avaliar a entrega de agentes terapêuticos para o espaço subretinal e para avaliar a toxicidade e eficácia na vivo. HR-SD-OCT usa perto de luz infravermelha (800-880 nm) e tem ótica especificamente projetada para a única ótica do olho do rato com resolução axial mícron-sub-2. Modelos de rato transgénico da degeneração retiniana externa (fotorreceptor) e controles foram fotografados para avaliar a progressão da doença. Microagulhas puxado de vidro foram usadas para entregar sub retiniana injeções de vírus adeno-associado (AAV) ou nanopartículas (NP) através de uma abordagem trans-escleral e trans-coroide. Cuidado de posicionamento da agulha no espaço subretinal foi necessário antes uma injeção de pressão calibrado, que proporciona o fluido para o espaço da retina sub. Tempo real de cirurgia subretinal realizou-se na nossa imagem sistema (RIS) da retina. HR-SD-OCT demonstrou progressiva degeneração retinal uniforme devido a expressão de uma tóxica mutante humana mutante rodopsina (P347S) transgene (RHOP347S) em ratos. HR-SD-OCT permite a quantificação rigorosa de todas as camadas da retina. Medidas de comprimento (OSL) espessura e fotorreceptoras do segmento externo camada nuclear externa (ONL) correlacionam-se com vitalidade fotoreceptor, degeneração ou resgate. O sistema de entrega RIS permite a visualização em tempo real de injeções subretinal em neonatal (~ P10-14) ou ratos adultos e HR-SD-OCT imediatamente determina o sucesso de entrega e mapeia a extensão de areal. HR-SD-OCT é uma ferramenta poderosa que pode avaliar o sucesso da cirurgia subretinal em camundongos, além da vitalidade dos FOTORRECEPTORES em vivode medição. HR-SD-OCT também pode ser usado para identificar o uniformes coortes animais para avaliar o grau de degeneração da retina, toxicidade e resgate terapêutico em estudos de pesquisa de terapia de gene pré-clínicos.
Introduction
Os investigadores estão a desenvolver terapias do gene para uma variedade de doenças degenerativas da retina e da retina com esperanças de traduzir novas terapêuticas em tratamentos para doenças humanas1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. no domínio do tempo ou a tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) tem sido usada para investigar os aspectos da degeneração da retina exterior em modelos do rato específico de doença12,13,14 . HR-SD-OCT não, no entanto, foi extensivamente usado no contexto da otimização de avaliação dos modelos de rato para determinar a taxa e a uniformidade espacial da degeneração da retina, ou no contexto da avaliação pré-clínica do gene com base terapêutica, por exemplo, a Avalie a extensão espacial do vetor entrega8,15,16, toxicidade ou resgate. Uma vez que um modelo do rato é caracterizado inteiramente, os dados de HR-SD-OCT podem servir como um recurso informativo e confiável para medir o impacto da terapêutica de exercer o resgate ou toxicidade em modelos do rato de degeneração da retina17. Muitos grupos estão usando injeção subretinal como um método de entrega de vetor devido a sua eficiência no transducing fotorreceptores e células do epitélio (RPE) pigmento da retina. No entanto, esta continua a ser um método difícil de dominar, dado que normalmente é feito por cirurgia mão livre da superfície da córnea e muitas vezes é repleta de catarata, sangramento e não intencionais destacamentos retinal ocorrem simplesmente por manipulação de posterior vítreo. Muitos grupos ainda tentam injeções subretinal cegamente e entregam o vírus usando injeções manuais com diâmetro relativamente grande aço inoxidável agulhas (34G)8,17,18,19 ,20,21,22e alguns usos óptico tomografia de coerência (OCT) para confirmar a entrega adequada de vetor para a retina8,17, de imagem 20 , 22. algumas melhorias no método recentemente têm sido descritas usando agulhas de microescala, impulsionadas por um micromanipulador22.
Apresentamos uma abordagem integrada que auxilia no posicionamento da agulha, e as injeções são facilitadas por um oftalmoscópio estéreo dirigido personalizado projetado no laboratório especificamente para visualização dentro do olho pequeno do rato17, 23. o uso de vidro puxado micro agulhas em conjunto com o micromanipulador estereotáxica fornecem melhor controle de colocação da agulha com nenhum corte cirúrgico para baixo necessária (ou seja, através da conjuntiva e do tecido conjuntivo) antes de injeção. O uso da pressão regulada injector micro ajuda entregar volumes de injeção consistente, e a injeção pode ser feita com muito maior estabilidade, precisão e muito mais lenta do que injeções manuais realizadas por uma seringa à mão, diminuindo assim o ocorrência de injeção de bolha no olho. A agulha menor ajuda a evitar vazamentos após a retirada da agulha, porque o caminho é auto-selante. Para avaliar a extensão da injeção/entrega, muitos grupos de investigação dependem de encontrar e avaliar a extensão de areal da expressão de proteínas (EGFP) fluorescência verde reforçada na retina (construção de expressão entregada pelo vetor) na extremidade experimental ponto (eutanásia) para confirmar o sucesso injeções11,19,20,24. Esta abordagem (não utilizando OCT) para verificar o sucesso cirúrgico desperdiça uma quantidade enorme de recursos em tempo de procedimento cirúrgico e animais, uma vez que todos os animais com falhas cirúrgicas (desconhecidos) precisam ser mantida, seguido com medidas repetitivas até colheita de eutanásia e olho (quando EGFP é medido). Confirmação do local da injeção na retina pode ser melhorada usando HR-SD-OCT para demonstrar que a injeção está localizada entre as camadas corretas da retina (ou seja, o espaço subretinal). HR-SD-OCT também pode ser usado para delinear imediatamente tentativas (falhas cirúrgicas) para identificar as variáveis relevantes em tempo real cirúrgico para aperfeiçoar a abordagem. Nós achamos que HR-SD-OCT fornece inúmeras vantagens no gene pré-clínicos estudos de terapia, permitindo rápida avaliação quantitativa da degeneração da retina exterior, permitindo a identificação/abate de animais de estudo que não cumpram critérios experimentais ( por exemplo, injeção subretinal incorreta) e para direcionar o follow-up de imagem para a região do olho, onde o vetor foi entregue (onde é mais provável efeito pré-clínicos), bem como controlar as regiões onde o vetor não foi entregue. Desde o seu desenvolvimento, o uso de SD-out tem continuado a ser aceito e utilizado pelos pesquisadores de Oftalmologia e agora é considerada o padrão de imagem da retina em estudos científicos da retina no rato ou roedor modelos13,25. HR-SD-OCT e seus recursos de software foram utilizados em maneiras originais de integrada para promover o objetivo da terapia bem sucedida gene quantitativa em modelos do rato em cada etapa do processo, incluindo a seleção de modelo animal, caracterização de degeneração no escolhido modelos de doença, entrega terapêutica, mapeamento de vetor entrega e avaliação de toxicidade/eficácia. O uso de HR SD-out permite a descoberta de medicamentos mais eficiente em todos os níveis do processo. Aqui descrevemos essas abordagens que são usadas em nosso programa de descoberta de drogas de RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
HR-SD-OCT fornece um método simples para a caracterização de potenciais modelos animais de doença humana para determinar sua utilidade na terapêutica potencial de teste. A capacidade de rapidamente e confiantemente caracterizam um potencial modelo animal de doença humana é fundamental para o processo de descoberta de drogas terapêuticas (por exemplo, terapia de substituição genética, terapia de gene “knockdown” ribozima ou shRNA, terapia genética combinada). HR-SD-OCT fornece um método simples, ráp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material é baseado em trabalho suportado, em parte, pelo departamento de assuntos de veteranos (VA), Veterans Health Administration, escritório de pesquisa e desenvolvimento (biomédica de laboratório de pesquisa e desenvolvimento) (VA mérito Grant 1I01BX000669). JMS é empregado, em parte, como pessoal médico-cientista, Oftalmologia, por VA porque; MCB é empregado, em parte, pela VA porque. O estudo foi realizado em e apoiado em parte, os veteranos administração Western New York Healthcare System (Buffalo, NY). Conteúdo não representam a opinião do departamento de assuntos de veteranos ou o governo dos Estados Unidos. Também apoiou, em grande parte, pelo NIH/NEI R01 conceder EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 conceder EY016662 (centro de infraestrutura de visão de UB, PI: M abate, diretor – Biophotonics módulo: JMS), uma concessão irrestrita para a departamento de Oftalmologia/Universidade Búfalo de investigação para evitar cegueira (Nova Iorque, NY) e uma bolsa da Fundação Oishei (Buffalo, NY). Reconhecemos o dom da linha deP347S de hC1 transgénica RHOe o mouse do exon 1 RHO nocaute do Dr. Janis Lem (centro médico de Tufts Nova Inglaterra, Boston, MA) e o dom do modelo no estado heterozigoto transgene NHR-E sobre o rato exon 2 RHO nocaute segundo plano de DRS G. Jane Farrar e Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).
Materials
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
Riferimenti
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