Сверхвысоких резолюции мышь оптическая когерентная томография помощи внутриглазных инъекций в исследованиях сетчатки генной терапии
Summary
Здесь мы продемонстрировать новаторский подход к использованию высокого разрешения спектральной области оптическая когерентная томография (HR-SD-Окт) для содействия доставке генной терапии агентов в пространство субретинальное, оценить его ареал освещение и характеризуют фоторецепторных жизнеспособность.
Abstract
HR-SD-OCT используется для контролировать прогрессирование фоторецепторных дегенерации в прямом мыши модели, оценить доставки терапевтических агентов в субретинальное пространство и для оценки токсичности и эффективность в естественных условиях. HR-SD-Окт использует около инфракрасного света (800-880 Нм) и имеет оптику специально разработан для уникальных оптики глаза мыши с суб-2-микрон осевой резолюции. Трансгенные мыши модели внешних сетчатки (фоторецепторных) вырождение и контроля были образы оценить прогрессирования заболевания. Вытащил стеклянной микроиглы были использованы для доставки суб сетчатки инъекции аденоассоциированный вирус (AAV) или наночастиц (NP) через транс склеры и транс хориоидеи подход. Тщательно позиционировать кончик иглы в пространство субретинальное требовалось до калиброванный инъекция, которая поставляет жидкость в суб сетчатки пространство. Реальном времени субретинальное хирургии было проведено на нашей сетчатки системы (RIS). HR-SD-Окт продемонстрировал прогрессивного единообразных дегенерации сетчатки вследствие выражение токсичных мутант человека мутантов родопсина (P347S) (РоP347S) трансген мышей. HR-SD-OCT позволяет строгой количественной оценки всех слоев сетчатки. Наружный слой ядерной (ONL) толщина и фоторецепторных измерения длины (OSL) наружный сегмент коррелируют с фоторецепторных жизнеспособность, дегенерация или спасения. Система доставки RIS позволяет в реальном времени визуализации субретинальное инъекции в неонатальной (~ P10-14) или взрослых мышей, HR-SD-Окт немедленно определяет успех доставки и карты и ареал степени. HR-SD-Окт является мощным инструментом, который можно оценить успех субретинальное хирургии в мышей, в дополнение к оценке жизнеспособности фоторецепторов в естественных условиях. HR-SD-Сен также может использоваться для определения единообразных животных когорты для оценки степени дегенерация сетчатки, токсичности и терапевтические спасения в доклинических гена терапии научных исследований.
Introduction
Исследователи разрабатывают генной терапии для различных дегенеративных заболеваний сетчатки и сетчатки с надежды перевода Роман терапии в лечение для болезней человека1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. время домена или спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Окт) был использован для изучения аспектов внешних дегенерации сетчатки в конкретных мыши модели болезни12,13,14 . HR-SD-OCT не, однако, был широко используется в контексте оптимизации оценки моделей мыши для определения темпов и пространственной однородности дегенерации сетчатки, или в контексте доклинических оценки гена на основе терапии, например, к оценить спасения, токсичность или пространственные масштабы векторных доставки8,,1516. После того, как полностью характеризуется модель мыши, HR-SD-Окт данных может служить информативным и надежного ресурса для измерения влияния терапии приложить спасения или токсичности в моделях мыши дегенерации сетчатки17. Многие группы используют субретинальное инъекции как метод доставки векторных благодаря своей эффективности в преобразователя фоторецепторных клеток и клеток сетчатки пигментного эпителия (ПЭС). Однако это остается сложным метод мастер, учитывая, что это обычно делается путем операции свободной рукой от поверхности роговицы и часто сопряжено с катарактой, кровотечение и непреднамеренные отслоения сетчатки происходит просто путем манипуляций задней стекловидного тела. Многие группы по-прежнему пытаются субретинальное инъекции слепо и доставить вирус с помощью ручного инъекции с относительно большого диаметра из нержавеющей стали иглы (34G)8,,1718,19 ,20,21,22и несколько использует оптическая когерентная томография (Окт) imaging для подтверждения надлежащего доставки вектора к сетчатке8,17, 20 , 22. Некоторые улучшения в методе недавно были описаны с помощью иглы микромасштабной, движимый микроманипулятор22.
Мы представляем комплексный подход, который помогает в позиционирования иглы, и инъекции способствуют пользовательских режиссер стерео офтальмоскоп, разработанный в лаборатории специально для визуализации внутри небольшой глаз мыши17, 23. Использование микро иглы вытащил стекла в сочетании с стереотаксического микроманипулятор обеспечивают лучшее управление иглы с не хирургическим сократить требуемый (т.е., через хлогексидином и соединительной ткани) до инъекции. Использование давления регулируется микро инжектор помогает доставить последовательного впрыска томов, и инъекции может быть сделано с гораздо большей стабильностью, точность и гораздо медленнее, чем ручной инъекций, выполняемых ручной шприц, снижая возникновение пузырь инъекции в глаз. Меньшие иглу помогает предотвратить утечки после вывода иглы, потому что путь самоуплотняющийся. Для оценки степени инъекция/доставки, многие следственные группы полагаются на поиске и оценке площадной степени расширение зеленый флуоресценции белков (EGFP) в сетчатке (построить выражение выступил вектор) в конце экспериментального точка (эвтаназия) для подтверждения успешного инъекции11,19,20,24. Этот подход (не используя OCT) чтобы убедиться, что хирургические успеха отходов огромное количество ресурсов в хирургической процедуры время и животных, так как все животные с (неизвестных) хирургические ошибки необходимо сохранить, затем с повторяющихся мер до урожай эвтаназии и глаз (когда измеряется EGFP). Подтверждение местоположения инъекций в сетчатке может быть улучшено с помощью HR-SD-Окт продемонстрировать, что инъекции расположен между правильным слоев сетчатки (т.е. субретинальное пространства). HR-SD-Окт может также использоваться для немедленно разграничить неудачных попыток (хирургические ошибки) для выявления соответствующих переменных в реальных хирургические время улучшить подход. Мы обнаружили, что HR-SD-OCT предоставляет многочисленные преимущества в доклинических ген исследования терапии, позволяя быстрое количественной оценки внешних дегенерация сетчатки, позволяя идентификации/забой животных исследования, которые не отвечают критериям экспериментальных ( Например, неправильный субретинальное инъекций) и для прямой последующей визуализации в регион глаза где вектор был доставлен (где доклинические эффект скорее), а также управления регионами, где вектор не было доставлено. С момента своего развития, использование SD-Окт продолжает быть приняты и использованы исследователями офтальмологии и в настоящее время считается стандартом сетчатки отображения сетчатки научных исследований в мышь или грызун модели13,25. HR-SD-OCT и его возможности программного обеспечения были использованы в уникальных комплексных способов достижения цели успешного количественный генной терапии в моделях мыши на каждом шагу в процессе, включая выбор Животные модели, характеристика дегенерации в выбранной модели заболеванием, терапевтические доставки, отображение вектора доставки, и токсичность/эффективность оценки. Использование HR-SD-OCT позволяет для более эффективных лекарственных препаратов на всех уровнях этого процесса. Здесь мы опишем эти подходы, которые используются в нашей программе РНК лекарственных препаратов.
Protocol
Representative Results
Discussion
HR-SD-OCT предоставляет простой метод для определения характеристик потенциальных животных моделей болезней человека, чтобы определить их полезность в тестировании потенциальные терапии. Способность быстро и надежно характеризуют потенциальной модели животных болезней человека имеет …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот материал основан на работе, в частности, поддерживается Департаментом по делам ветеранов (VA), ветеранов здравоохранения администрации, управления исследований и развития (биомедицинские лаборатории исследования и развития) (Грант заслуги ва 1I01BX000669). JMS используется, в частности, как врач-научный сотрудник, офтальмологии, ва площадей; MCB используется, в частности, ва площадей. Исследование было проведено на и частично поддерживается система здравоохранения ветеранов администрации Западной Нью-Йорка (Буффало, Нью-Йорк). Содержание не отражает мнения Департамента по делам ветеранов или правительства Соединенных Штатов. Также поддерживается, в основную часть, по NIH/НЭЙ R01 Грант EY013433 (PI: JMS), NIH/НЭЙ R24 Грант EY016662 (UB видение инфраструктуры центр, PI: M убоя, директор – биофотоники модуль: JMS), неограниченный Грант для кафедры офтальмологии/университета в Буффало от исследования, чтобы предотвратить слепоту (Нью-Йорк, Нью -Йорк) и Грант от Фонда Oishei (Буффало, Нью-Йорк). Мы признаем дар Нс1 трансгенных РоP347S линии и мыши экзона 1 Ро нокаут от д-р Янис Lem (медицинский центр Новой Англии Тафтса, Бостон, штат Массачусетс) и дар НПЧ-E трансген модель в состоянии гетерозиготных на мышь экзона 2 Ро нокаут фон от Drs. G. Джейн Фаррар и Питер Humphries (Тринити-колледж, Дублин, IRE).
Materials
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
Riferimenti
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al, , et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
