Induzione e diagnosi dei tumori in<em> Drosophila</em> Imaginal Disc Epithelia
Summary
L'analisi del clone di mosaico nel disco epiteliale di Drosophila imaginal è un potente sistema di modelli per studiare i meccanismi genetici e cellulari della tumorigenesi. Qui descriviamo un protocollo per indurre tumori nei dischi immaginari di ala Drosophila utilizzando il sistema GAL4-UAS e introdurre un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi tumorali.
Abstract
Nelle prime fasi del cancro, le cellule mutanti trasformate mostrano anomalie citologiche, iniziano la sovrabbondanza incontrollata e progressivamente distruggono l'organizzazione tissutale. Drosophila melanogaster è emerso come un popolare sistema di modelli sperimentali nella biologia del cancro per studiare i meccanismi genetici e cellulari della tumorigenesi. In particolare, gli strumenti genetici per i dischi imaginal Drosophila (sviluppo epitelio in larva) consentono la creazione di cellule pro-tumor trasformate all'interno di un normale tessuto epiteliale, una situazione simile a quella iniziale del cancro umano. Un recente studio sulla tumorigenesi nei dischi imaginali dell'ala Drosophila ha tuttavia dimostrato che l'iniziazione del tumore dipende dalla citoarchitettura intrinseca del tessuto e dal microambiente locale, suggerendo che sia importante considerare la suscettibilità specifica della regione a stimoli tumorigenici nella valutazione dei fenotipi tumorali in immagini dischi. Per facilitare l'analisi fenotipica dei progressi tumoraliIn dischi immaginari, qui descriviamo un protocollo per esperimenti genetici usando il sistema GAL4-UAS per indurre tumori neoplastici nei dischi imaginal di ala. Abbiamo inoltre introdotto un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi delle lesioni clonali indotte nell'epitelio immaginario, poiché un metodo di classificazione chiaro per discriminare le varie fasi della progressione tumorale (come iperplasia, displasia o neoplasia) non era stato precedentemente descritto. Questi metodi potrebbero essere generalmente applicabili all'analisi clonale dei fenotipi tumorali nei vari organi di Drosophila .
Introduction
I tessuti epiteliali sono sistemi altamente organizzati che hanno la straordinaria abilità homeostatica per mantenere la propria organizzazione attraverso lo sviluppo e il fatturato delle cellule. Questo robusto sistema di auto-organizzazione, tuttavia, è progressivamente interrotto durante lo sviluppo del tumore. All'inizio dello sviluppo del tumore, all'interno di uno strato epiteliale emergono singole cellule mutanti derivanti dall'attivazione di oncogene o dall'inattivazione del gene del soppressore tumorale. Quando questa "cellula pro-tumorica" trasformata evita un ambiente soppressivo, interferisce con l'organizzazione epiteliale e inizia la proliferazione incontrollata, la tumorigenesi si verifica 1 . Negli ultimi decenni, i notevoli progressi tecnologici nella genetica e nella biologia molecolare hanno fatto notevoli progressi sulla ricerca sul cancro. In particolare, recenti studi che utilizzano gli strumenti di analisi genetica mosaica in Drosophila melanogaster , come il recupero mitotico FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase target)2 e flip-out-GAL4-UAS (sequenza di attivazione a monte) 3 , hanno contribuito notevolmente a una migliore comprensione dei meccanismi genetici coinvolti nella formazione e nella metastasi dei tumori 4 , 5 , 6 .
Studi di un gruppo di geni gonfiori letali di Drosophila conservati, larve giganti letali ( lgl ), dischi di grandi dimensioni ( dlg ) e scribble ( scrib ), hanno evidenziato il rapporto critico tra la perdita di organizzazione epiteliale e lo sviluppo del tumore, in quanto questi geni svolgono ruoli chiave Nella regolazione della polarità delle cellule apicala-basali e della proliferazione cellulare nei tessuti epiteliali 7 . Mentre i dischi imaginal di Drosophila sono normalmente epiteli monolayered, mutazioni omozigote in ognuno di questi tre geni provocano la perdita della struttura e della polarità delle cellule, non differisconoReniate, sovraproliferano e, in ultima analisi, formano masse amorfe multistrato che si fusono con i tessuti adiacenti 7 . Allo stesso modo, la distruzione di questi geni nei mammiferi è coinvolta nello sviluppo di tumori maligni 8 , 9 . I fenotipi neoplastici esposti dai tessuti mutanti hanno portato alla classificazione di questi tre geni come geni conservati, neoplastici del soppressore del tumore (nTSGs) 7 , 8 . Tuttavia, quando le cellule mutanti nTSG omozigoti vengono generate sporadicamente nello sviluppo di dischi immaginari di tipo selvaggio utilizzando la ricombinazione mitotica mediata da FLP-FRT, le cellule mutanti vengono eliminate dal tessuto attraverso l'apoptosi 10 , 11 , dipendente dalla c-Jun N-terminale chinasi (JNK) , 12 , 13 , 14 , estrusione 15 </suP , 16 , o engulfment e fagocitosi da parte dei vicini 17 . In questa epiteli geneticamente mosaica, l'apoptosi viene rilevata per lo più nelle cellule mutanti nTSG situate al limite del clone, suggerendo che le cellule normali adiacenti innescano l'apoptosi delle cellule mutanti nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Recenti studi sulle cellule di mammiferi hanno confermato che questa eliminazione cellulare delle cellule pro-tumoriche è un meccanismo evolutivamente protetto contro il cancro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Un recente studio sui dischi imaginal Drosophila , tuttavia, ha mostrato che i cloni mosaici nTSG-knockdown inducono tumori neoplastici in specificiRegioni dei dischi imaginal di ala 16 . La formazione tumorale iniziale è sempre stata trovata nella regione "cerniera" periferica e non è mai stata osservata nella regione "pouch" centrale dell'epitelio del disco dell'ala, suggerendo che il potenziale tumorigenico delle cellule ntsg-knockdown dipende dall'ambiente locale. La regione del sacchetto centrale funge da "freddo" del tumore in cui le cellule pro-tumorali non mostrano sovrapposizione displastica, mentre la regione di cerniera periferica si comporta come un "hotspot tumorale" 16 . Nelle regioni di sacche di "coldspot", le cellule ntsg-knockdown si delaminano dal lato basale e subiscono l'apoptosi. Al contrario, poiché le cellule a cerniere "hotspot" possiedono una rete di robuste strutture citoscheletriche sui loro lati basali, le cellule di coltura nTSG delaminano dal lato apicale dell'epitelio e iniziano la crescita tumorigenica 16 . Pertanto, l'analisi dei fenotipi tumorali nei dischi immaginari richiede un'attenta analisiDerazione della suscettibilità specifica per regione a stimoli tumorigenici.
Qui descriviamo un protocollo per indurre la formazione di tumori neoplastici nei dischi imaginali dell'ala Drosophila che utilizzano il sistema GAL4-UAS- RNAi mediante i quali vengono generati nTSG-knockdown cellule nell'epitelio normale dell'ala. Anche se questi sistemi sperimentali sono utili per studiare le fasi iniziali del cancro, non è stato chiaramente descritto chiaramente un metodo di classificazione chiaro per valutare le fasi della progressione tumorale nell'epitelio disco immaginario. Pertanto, proponiamo anche un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi clonali pro-tumori indotti nell'epitelio di alafibre in tre categorie: iperplasia (accumulazione di un numero eccessivo di cellule apparenti normali con proliferazione aumentata), displasia (tessuto premaligeno composto da anomalie apparenti Cellule) e neoplasie (tumore benigno o maligno composto da cellule aventi un aspetto anomalo e pattern anomalo di proliferazione).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema GAL4-UAS è uno degli strumenti genetici più potenti per l'espressione genica mirata in Drosophila 26 e consente notevolmente l'induzione e l'analisi delle cellule tumorali in vivo 4 . Questo sistema consente la generazione di cloni che portano a eliminare i geni del soppressore tumorale o sovraespressione di oncogeni all'interno del tessuto epiteliale di tipo selvaggio, una situazione molto simile agli stadi iniziali del cancr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo J. Vaughen per una lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 e la Fondazione di Ricerca di Takeda Science Grant a YT
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
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