स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता वाली जीन नॉकआउट्स के चयन-आश्रित और स्वतंत्र जनरेशन
Summary
आनुवंशिक रूप से दैहिक सेल लाइनों में हेरफेर करने की क्षमता में हालिया अग्रिम बुनियादी और व्यावहारिक अनुसंधान के लिए महान संभावनाएं हैं। यहां, हम सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 के लिए दो दृष्टिकोण पेश करते हैं, जिसमें नॉनआउट आउट उत्पादन और स्तनधारी सेल लाइनों में स्क्रीनिंग शामिल है, साथ ही चयन मार्करों के उपयोग के बिना।
Abstract
सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीनोम इंजीनियरिंग सिस्टम ने थोड़ा प्रयास करके सटीक जीनोम संपादन के लिए अनुमति देकर जीव विज्ञान में क्रांति ला दी है। एक एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) द्वारा निर्देशित किया गया है जो विशिष्टता प्रदान करता है, कैस 9 प्रोटीन लक्षित लोकस पर डीएनए किलों दोनों को साफ़ करता है। डीएनए ब्रेक या तो गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल हो रहे हैं (एनएचईजे) या समरूपता से संबंधित मरम्मत (एचडीआर)। एनएचईजे लघु विलोपन या सम्मिलन पेश कर सकता है जिससे फ्रेम-पारी में परिवर्तन होता है, जबकि एचडीआर बड़े और अधिक सटीक उलझन के लिए अनुमति देता है। यहां, हम डाउनस्ट्रीम चयन / स्क्रीनिंग के लिए दो विकल्पों के साथ स्थापित CRISPR / Cas9 विधियों को जोड़कर नॉकआउट सेल लाइन बनाने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। NHEJ दृष्टिकोण एक एकल एसजीआरएनए कट साइट और चयन-स्वतंत्र स्क्रीनिंग का उपयोग करता है, जहां प्रोटीन का उत्पादन उच्च-थ्रिप्ट तरीके से डॉट इम्यूनोबलॉट द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। एचडीआर दृष्टिकोण दो एसजीआरएनए कट साइट का उपयोग करता है जो ब्याज की जीन को फैलाते हैं। प्रदान किए गए एचडीआर टेम्प्लेट के साथ, इस पद्धति को हटाए जा सकता हैकेबी के दसियों, डाला चयन प्रतिरोध प्रतिरोध मार्कर द्वारा सहायता प्राप्त। प्रत्येक विधि के उपयुक्त अनुप्रयोगों और फायदे पर चर्चा की जाती है।
Introduction
स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन सेलुलर गड़बड़ी के क्षणिक तरीकों पर एक लाभ प्रदान करते हैं, जो उनकी दक्षता और अवधि में चर हो सकता है। 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , झिंक-फिंगर न्यूक्लियोज़ जैसे लक्षित विशिष्ट न्युक्लिअल्स के विकास के कारण हाल के वर्षों में जीनोमिक संपादन तेजी से सामान्य हो गया है, ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-जैसे प्रभावकारी न्यूक्लेअसेज़ (टीएएलएन) 6 , 7 , 8 , 9 और आरएनए द्वारा निर्देशित न्यूक्लेयस क्लस्टर किए गए, नियमित रूप से अंतःस्थापित लघु रिल्लींड्रोमिक दोहराव (सीआरआईएसपीआर) प्रणाली 10 से प्राप्त हुए हैं ।
सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 संपादन मशीनरी एक प्रतिरक्षा प्रणाली से जुड़ा है जो बैक्टीरिया और आर्चिया वायरल संक्रमणों से बचाव के लिए उपयोग करती हैगधा = "xref"> 11 , 12 , 13 इस प्रक्रिया में, कम, वायरल अनुक्रम पर हमला करने के 20-30 एनटी टुकड़े एक जीनोमिक बिन्दु में शामिल किए जाते हैं क्योंकि इकाइयों 14 , 15 को दोहराते हुए "स्पेकर्स" निकलते हैं। अनुवर्ती प्रतिलेखन और आरएनए प्रसंस्करण छोटे सीआरआईएसपीआर से जुड़े आरएनए 16 (सीआरआरएनए) को उत्पन्न करता है, कि एक ट्रांस-सक्रिय CRRNA 17 (tracrRNA) के साथ, प्रभावकार कैस 9 एंडोन्यूक्लेज़ के साथ इकट्ठा होता है। सीआरआरएनए इस प्रकार सीएस 9 लक्ष्यीकरण के लिए विशिष्टता प्रदान करते हैं, जटिल वायरल डीएनए दृश्यों को साफ करने और आगे संक्रमण 18 , 1 को रोकने के लिए जटिल मार्गदर्शन करते हैं। लक्षित डीएनए में कोई भी "प्रोटॉस्पासर" क्रम सीआरआरएनए के स्रोत के रूप में सेवा कर सकता है, जब तक कि एस 5 के मामले में एनजीजी एक छोटी प्रोटॉस्पेयर आसन्न आकृति (पीएएम) के लिए सीधे 5 है। <sअप क्लास = "xref"> 20 मेजबान के सीआरआईएसपीआर स्थान के स्पेसर के निकट पीएएम अनुक्रम की अनुपस्थिति, स्वयं और गैर-आत्म के बीच अंतर करती है, मेजबान के लक्ष्य को रोकने में। इसकी सार्वभौमिकता और लचीलेपन के कारण, इस जैविक प्रणाली को जीनोमिक संपादन के लिए शक्तिशाली ढंग से अनुकूलित किया गया है, जैसे कि किसी भी पीएएम-आसन्न डीएनए साइट को लक्षित किया जा सकता है इस संस्करण में, एक और संशोधन ने CRRNA और tracrRNA को एक एकल आरएनए (एसजीआरएनए) घटक में कैस 9 प्रोटीन 21 में लोड किया गया है।
कैस 9 और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में एक एसजीआरएनए की अभिव्यक्ति पर, कैस 9 प्रोटीन लक्षित लोकस पर डीएनए किलों दोनों को साफ़ करता है। मुताबिक़ अनुक्रम के उपयुक्त क्षेत्र की अनुपस्थिति में, सेल गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) 22 , 23 , 24 के माध्यम से इस ब्रेक को हल करता है, जो आमतौर पर छोटे विलोपन का परिचय देता है या, शायद ही कभी, सम्मिलन जब एक खुला लक्ष्यीकरणपढ़ना फ्रेम, मरम्मत की संभावना एक अनुवादक frameshift की ओर जाता है जो एक गैर-कार्यात्मक प्रोटीन उत्पाद का उत्पादन करता है। इसके विपरीत, जब समरूपता के बड़े क्षेत्रों के साथ एक बाहरी टेम्प्लेट के साथ प्रदान किया जाता है, तो सेल द्वारा दोहराए गए विराम के अनुसार समरूपता की मरम्मत 25 , 26 को ठीक कर सकता है। इस मार्ग से जीसॉम में बड़े सटीक विलोपन, प्रतिस्थापन या सम्मिलन की अनुमति मिल सकती है, जो कि एक्सीएबल चयन मार्करों 27 के परिचय के साथ मिलकर जुटाई जा सकती है।
यहां, हम इन दो सीआरआईआईएसपीआर / कास 9 तरीकों ( चित्रा 1 ए ) में से किसी एक से नॉकआउट सेल लाइन बनाने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। NHEJ दृष्टिकोण एक एकल एसजीआरएनए कट साइट और चयन-स्वतंत्र स्क्रीनिंग का उपयोग करता है, और इस प्रकार थोड़ा अग्रिम तैयारी की आवश्यकता होती है। इस पद्धति का उपयोग करते समय, प्रतिलिपि के 5 'अंत के पास एक्सॉन के पूरक आरएनए को मार्गदर्शन करते हैं, जो कि एक नॉकआउट बनाने की सबसे अधिक संभावना है, डिजाइन किए जाने चाहिए। संशोधित होने के बाद सेइस मामले में जीनोम के लिए आयन छोटे होते हैं, नॉकआउट क्लोन के लिए स्क्रीनिंग डॉट ब्लाट पर आधारित होती है, जहां प्रोटीन उत्पाद को उच्च-थ्रिप्ट तरीके से मूल्यांकन किया जाता है। हम एक उदाहरण के रूप में ELAV जैसी 1 प्रोटीन (ELAVL1) नॉकआउट लाइनों की पीढ़ी का उपयोग करते हैं दूसरा दृष्टिकोण समरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) पर निर्भर करता है और दो एसजीआरएनए कट साइट्स का उपयोग करता है जो कि जीन या हित के क्षेत्र में फैला है, जिससे केबी के दसियों के विलोपन की अनुमति मिलती है समालोचना के दो क्षेत्रों के साथ एक प्लाज्मिड जो दरार साइटों की ओर जाता है एक प्रतिस्थापन टेम्पलेट ( चित्रा 1 बी ) प्रदान करता है, एक चयन प्रतिरोध मार्कर पेश करता है जो पीटा नॉकआउट पीढ़ी की दक्षता बढ़ाता है। इस पद्धति को भी जीन संशोधनों को लागू करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ताकि उचित रूप से डिजाइन किया गया समरूपता हथियार हो। इस मामले में, एक नया डीएनए टुकड़ा का एकीकरण पीसीआर आधारित स्क्रीनिंग ( चित्रा -1 सी ) के लिए अनुमति देता है। यहां, हम एक उदाहरण के रूप में Pumilio आरएनए बाध्यकारी परिवार के सदस्य 2 (पीओएम 2) पीटा पीढ़ी का उपयोग करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली ने स्थिर जीनोमिक संशोधनों के कुशल उत्पादन की अनुमति दी है, जो अन्य क्षणिक हेरफेर विधियों के लिए एक अधिक सुसंगत विकल्प प्रदान करते हैं। यहां, हम स्तनधारी सेल लाइनों में सीआ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने अभिकर्मकों को साझा करने के लिए प्रायोगिक सहायता के लिए गिसेल सचेज़, मेगन ली, और जेसन एस्टेप को स्वीकार करना चाहूंगा, और Weifeng Gu और Xuemei चेन।
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
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