Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих
Summary
Недавние достижения в способности генетически манипулировать соматическими клеточными линиями имеют большой потенциал для фундаментальных и прикладных исследований. Здесь мы представляем два подхода для производства и скрининга генерируемых нокаутом CRISPR / Cas9 в клеточных линиях млекопитающих с использованием и без использования селективных маркеров.
Abstract
Инженерная система генома CRISPR / Cas9 произвела революцию в области биологии, позволив без особого труда точно редактировать геном. Управляемый одной направляющей РНК (sgRNA), которая придает специфичность, белок Cas9 расщепляет обе линии ДНК в целевом локусе. Разрыв ДНК может вызывать либо не гомологичное концевое соединение (NHEJ), либо гомологичный направленный ремонт (HDR). NHEJ может вводить небольшие делеции или вставки, которые приводят к мутациям смены кадров, тогда как HDR допускает большие и более точные возмущения. Здесь мы представляем протоколы для генерации клеточных линий нокаута путем связывания установленных методов CRISPR / Cas9 с двумя вариантами выбора / скрининга ниже по течению. Подход NHEJ использует единый сайт расщепления sgRNA и независимый от отбора скрининг, где производство белка оценивается точным иммуноблотом с высокой пропускной способностью. В методе HDR используются два сайта, разрезающих sgRNA, которые охватывают интересующий ген. Вместе с предоставленным шаблоном HDR этот метод может обеспечить удалениеИз десятков kb, чему способствует вставленный селективный маркер сопротивления. Обсуждаются соответствующие приложения и преимущества каждого метода.
Introduction
Стабильные генетические изменения обеспечивают преимущество перед переходными методами клеточного возмущения, которые могут быть переменными по эффективности и продолжительности. Геномное редактирование становится все более распространенным в последние годы из-за развития целевых специфических нуклеаз, таких как нуклеазы цинка-пальца 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , транскрипционные активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 И RNA-направленные нуклеазы, полученные из кластеризованной, регулярно интерполированной системы коротких палиндромных повторов (CRISPR) 10 .
Механизм редактирования CRISPR / Cas9 адаптирован из иммунной системы, которую используют бактерии и археи для защиты от вирусных инфекцийAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . В этом процессе короткие, 20-30 н.т. фрагменты инвазионной вирусной последовательности включены в геномный локус в виде «спейсеров», фланкированных повторяющимися звеньями 14 , 15 . Последующая транскрипция и обработка РНК генерируют небольшие CRISPR-ассоциированные РНК 16 (crRNAs), которые вместе с транс-активирующей кРНК 17 (tracrRNA) собираются с эффекторной эндонуклеазой Cas9. Таким образом, кРНК обладают специфичностью к таргетированию каз9, направляя комплекс для расщепления комплементарных последовательностей вирусных ДНК и предотвращения дальнейших инфекций 18 , 19 . Любая последовательность «protospacer» в целевой ДНК может служить источником crRNA, если она непосредственно 5 'к короткому протоспасферу, смежному мотиву (PAM), NGG в случае S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. Отсутствие последовательности PAM вблизи спейсера в локусе CRISPR хоста различает «я» и «не-я», предотвращая нацеливание хоста. Из-за своей универсальности и гибкости, эта биологическая система была сильно адаптирована для геномного редактирования, так что почти любой сайт, расположенный рядом с PAM, может быть нацелен. В этой версии дополнительная модификация сливала crRNA и tracrRNA в один направляющий РНК (sgRNA) компонент, который загружается в белок Cas9 21 .
При экспрессии Cas9 и sgRNA в эукариотических клетках белок Cas9 расщепляет обе линии ДНК в целевом локусе. В отсутствие подходящей области гомологичной последовательности клетка фиксирует этот разрыв через не гомологичное концевое соединение (NHEJ) 22 , 23 , 24 , которое обычно вводит небольшие делеции или, реже, вставки. При таргетинге на открытыйРамка считывания, ремонт, вероятно, приводит к поступательному сдвигу кадров, который создает нефункциональный белковый продукт. Напротив, при наличии экзогенной матрицы с большими областями гомологии клетка может фиксировать разрыв двух нитей с помощью гомологичного направленного ремонта 25 , 26 . Этот маршрут допускает более крупные точные удаления, замены или вставки в геноме в сочетании с введением маркеров подакцизного выделения 27 .
Здесь мы представляем протоколы для генерации клеточных линий нокаута одним из этих двух методов CRISPR / Cas9 ( рисунок 1A ). Подход NHEJ использует единый сайт расщепления sgRNA и независимый от отбора скрининг и, следовательно, требует небольшой предварительной подготовки. При использовании этого метода необходимо разработать направляющие РНК, дополняющие экзоны около 5'-конца транскрипта, которые, скорее всего, будут производить нокаут. Поскольку modificatИонов в этом геноме мало, скрининг на клоны для нокаутов основан на дот-блотах, где белковый продукт оценивается с высокой пропускной способностью. В качестве примера мы используем выработку линий выведения ELAV-like 1 (ELAVL1). Второй подход основан на восстановлении гомологии (HDR) и использует два сайта среза sgRNA, которые охватывают ген или область интереса, что позволяет удалять десятки килобайт. Плазмида с двумя регионами гомологии, которые расположены по участкам расщепления, обеспечивает шаблон замены ( фиг. 1B ), вводя селективный маркер сопротивления, который повышает эффективность генерации нокаута. Этот метод также может быть адаптирован для введения модификаций генов с правильно разработанными головками гомологии. В этом случае интеграция нового фрагмента ДНК позволяет проводить скрининг на основе ПЦР ( рис. 1С ). Здесь мы используем в качестве примера создание линий нокаута 2-го члена семейства Pumilio RNA (PUM2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Система CRISPR / Cas9 позволила обеспечить эффективную генерацию стабильных геномных модификаций, которые обеспечивают более последовательную альтернативу другим способам временного манипулирования. Здесь мы представили два метода быстрой идентификации нокаутов гена CRISPR / Cas9 в клеточны…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность Гисселу Санчесу, Меган Ли и Джейсону Эстепу за экспериментальную помощь, а также Вайфэн Гу и Сюэми Чэнь за обмен реагентами.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
Riferimenti
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetica. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetica. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetica. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetica. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
