哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代
Summary
体細胞株を遺伝子操作する能力の最近の進歩は、基礎研究および応用研究の大きな可能性を秘めている。ここでは、選択マーカーを使用した場合と使用しない場合の、哺乳類細胞株におけるCRISP / Cas9生成ノックアウト産生およびスクリーニングのための2つのアプローチを提示する。
Abstract
CRISPR / Cas9ゲノムエンジニアリングシステムは、わずかな労力で正確なゲノム編集を可能にすることによって生物学に革命をもたらしました。特異性を与える単一のガイドRNA（sgRNA）によって導かれ、Cas9タンパク質は、標的遺伝子座で両方のDNA鎖を切断する。 DNA破壊は、非相同末端結合（NHEJ）または相同性指向修復（HDR）のいずれかを引き起こす可能性がある。 NHEJは、フレームシフト突然変異をもたらす小さな欠失または挿入を導入することができ、一方、HDRはより大きくより正確な摂動を可能にする。ここでは、確立されたCRISPR / Cas9法を下流の選択/スクリーニングの2つの選択肢と結びつけることによってノックアウト細胞株を生成するためのプロトコールを提示する。 NHEJアプローチでは、単一のsgRNA切断部位および選択非依存性スクリーニングを使用し、ここでタンパク質産生は、ハイスループット様式でドットイムノブロットによって評価される。 HDRアプローチは、目的の遺伝子にまたがる2つのsgRNA切断部位を使用する。提供されたHDRテンプレートと一緒に、この方法は削除を達成することができます挿入された選択可能な抵抗マーカーによって助けられた数十kbの大きさであった。それぞれの方法の適切なアプリケーションと利点について説明します。
Introduction
安定した遺伝子改変は、細胞摂動の一時的な方法よりも利点を提供し、その効率および持続時間は可変であり得る。ゲノム編集は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ1,2,3,4,5、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）6,7,8,9などの標的特異的ヌクレアーゼの開発のために近年ますます一般的になってきているクラスター化され、規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム反復（CRISPR）システム10に由来するRNA誘導ヌクレアーゼを含む。
CRISPR / Cas9編集機は、細菌や古細菌がウイルス感染を防御するために使用する免疫システムに適合していますass = "xref"> 11,12,13。このプロセスでは、侵入するウイルス配列の短い20〜30ntフラグメントが、繰り返しユニット14,15に隣接する「スペーサー」としてゲノム座に組み込まれる。その後の転写およびRNAプロセシングにより、トランス活性化crRNA 17 （tracrRNA）とともに、エフェクターCas9エンドヌクレアーゼと組み立てられる小さなCRISPR関連RNA16（crRNA）が生成される。このようにして、crRNAは、相補性ウイルスDNA配列を切断し、さらなる感染を予防するために、複合体を誘導するCas9標的化への特異性を提供する18,19。標的DNA中のいずれかの「プロトスペーサー」配列は、短いprotospacer隣接モチーフ（PAM）、ストレプトコッカス・ピオゲネス Cas9の場合のNGG <sup class = "xref"> 20。宿主のCRISPR遺伝子座のスペーサーの近くにPAM配列がないことは、自己と非自己とを区別し、宿主の標的化を妨げる。その普遍性と柔軟性のために、この生物学的システムは、ほぼ全てのPAMに隣接するDNA部位を標的とすることができるように、ゲノム編集に強力に適合している。このバージョンでは、さらなる改変により、crRNAおよびtracrRNAが、Cas9タンパク質21にロードされる単一のガイドRNA（sgRNA）成分に融合した。
Cas9およびsgRNAを真核細胞で発現させると、Cas9タンパク質は、標的遺伝子座で両方のDNA鎖を切断する。相同配列の適切な領域が存在しない場合、細胞は、典型的には小さな欠失またはまれに挿入を導入する非相同末端結合（NHEJ） 22,23,24を介してこのブレークを固定する。オープンをターゲットとする場合修復は、おそらく非機能的なタンパク質産物を産生する翻訳フレームシフトにつながる。対照的に、大きな相同性領域を有する外因性鋳型を提供する場合、細胞は相同性指向修復により二本鎖切断を固定することができる25,26 。この経路は、切除可能な選択マーカー27の導入と相まって、ゲノムにおけるより大きな正確な欠失、置換または挿入を可能にする。
ここでは、これらの2つのCRISPR / Cas9法（ 図1A ）のいずれかによってノックアウト細胞株を生成するためのプロトコールを提示する。 NHEJアプローチは、単一のsgRNA切断部位および選択非依存性スクリーニングを使用するため、ほとんど準備を必要としない。この方法を使用する場合、ノックアウトを生成する可能性が最も高い、転写物の5 '末端近くのエクソンに相補的な誘導RNAを設計しなければならない。変更後この場合、ゲノムへのイオンの量は少なく、ノックアウトクローンのスクリーニングはドットブロットに基づいており、タンパク質産物はハイスループットの様式で評価される。我々はELAV様1タンパク質（ELAVL1）ノックアウト系の生成を例として使用する。第2のアプローチは相同性指向修復（HDR）に依拠し、数十kbの欠失を可能にする目的の遺伝子または関心領域にまたがる2つのsgRNA切断部位を使用する。切断部位に隣接する2つの相同性領域を有するプラスミドは、ノックアウト生成の効率を増加させる選択可能な耐性マーカーを導入する置換テンプレート（ 図1B ）を提供する。この方法は、適切に設計された相同性アームを用いて遺伝子改変を導入するために適合させることもできる。この場合、新しいDNA断片の組み込みにより、PCRベースのスクリーニングが可能になる（ 図1C ）。ここでは、Pumilio RNA binding family member 2（PUM2）ノックアウト系統の生成を例として使用します。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR / Cas9システムは、安定したゲノム改変の効率的な生成を可能にし、他の一時的な操作方法のより一貫した代替物を提供する。ここでは、哺乳動物細胞株におけるCRISPR / Cas9遺伝子ノックアウトの迅速な同定のための2つの方法を提示した。どちらの方法も細胞材料をほとんど必要としないため、クローン培養の初期段階で試験を行い、時間と試薬を節約できます。両方の方法の効率を上げ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、実験支援のためにGissell Sanchez、Megan Lee、Jason Estep、試薬を共有するWeifeng GuとXuemei Chenを認めたいと思っています。
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
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