Isolation des Pericytes de Type I et de Type II des Muscles Squelets de la Souris
Summary
Ce travail décrit un protocole basé sur FACS qui permet un isolement facile et simultané des pericètes de type I et de type II provenant des muscles squelettiques.
Abstract
Les pericytes sont des cellules multiperces perivasculaires qui présentent une hétérogénéité dans différents organes ou même dans le même tissu. Dans les muscles squelettiques, il existe au moins deux sous-populations périticées (appelées type I et type II), qui expriment différents marqueurs moléculaires et possèdent des capacités de différenciation distinctes. En utilisant des souris doublement transgéniques NG2-DsRed et Nestin-GFP, les pericytes de type I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) et de type II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) ont été isolées avec succès. Cependant, la disponibilité de ces souris à double transgénique empêche l'utilisation généralisée de cette méthode de purification. Ce travail décrit un protocole alternatif qui permet l'isolement facile et simultané des pericytes de type I et de type II à partir des muscles squelettiques. Ce protocole utilise la technique de tri cellulaire activée par fluorescence (FACS) et cible PDGFRβ, plutôt que NG2, avec le signal Nestin-GFP. Après l'isolement, type I et tyPe II pericytes présentent des morphologies distinctes. De plus, les pericytes de type I et de type II isolés avec cette nouvelle méthode, comme ceux isolés des souris doublement transgéniques, sont adipogènes et myogènes, respectivement. Ces résultats suggèrent que ce protocole peut être utilisé pour isoler les sous-populations de péricyte des muscles squelettiques et éventuellement d'autres tissus.
Introduction
La dystrophie musculaire est un trouble musculaire-dégénératif qui n'a jusqu'ici pas de traitements efficaces. Le développement de thérapies qui favorisent la régénération tissulaire a toujours été d'un grand intérêt. La régénération et la réparation des tissus après dommages dépendent des cellules souches / cellules progénitrices résidentes 1 . Les cellules satellites sont des cellules précurseurs myogènes actives qui contribuent à la régénération musculaire 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Leur utilisation clinique, cependant, est entravée par leur migration limitée et leur faible taux de survie après l'injection, ainsi que par leur diminution de la capacité de différenciation après l' amplification in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . En plus de satelliLes muscles squelettiques contiennent également de nombreuses autres populations de cellules avec un potentiel myogénique 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , telles que les cellules interstitielles positives du récepteur du facteur de croissance dérivées des plaquettes (PDGFRβ). Il existe des preuves montrant que les cellules PDGFRβ + dérivées de muscle peuvent se différencier en cellules myogènes et améliorer la pathologie musculaire et la fonction 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . Le PDGFRβ marque principalement les pericytes 21 , qui sont des cellules périvasculaires avec une pluripotence 22 , 23 . En plus de PDGFRβ, de nombreux autres marqueurs, y compris Neuron-Glial 2 (NG2) et CD146, sont également utilisés pour iDentify pericytes 21 . Il convient toutefois de noter qu'aucun de ces marqueurs n'est spécifique à un pericyte 21 . Des études récentes ont révélé deux sous-types de percytes musculaires, appelés type I et type II, qui expriment différents marqueurs moléculaires et réalisent des fonctions distinctes 19 , 24 , 25 . Biochimiquement, les pericytes de type I sont NG2 + Nestin – , tandis que les pericytes de type II sont NG2 + Nestin + 19 , 24 . Fonctionnellement, les pericytes de type I peuvent subir une différenciation adipogène, contribuant à l'accumulation de graisse et / ou à la fibrose, tandis que les pericytes de type II peuvent se différencier le long de la voie myogénique, ce qui contribue à la régénération musculaire 19 , 24 , 25 . Ces résultats démontrent que: (1) les pericytes de type I peuvent bE ciblés dans le traitement des troubles dégénératifs gras / fibrose, et (2) les pericytes de type II ont un grand potentiel thérapeutique pour la dystrophie musculaire. Une étude et une caractérisation plus poussées de ces populations nécessitent un protocole d'isolement qui permet de séparer les pericytes de type I et de type II à un haut niveau de pureté.
À l'heure actuelle, l'isolement des sous-populations de péricyte repose sur les souris doublement transgéniques NG2-DsRed et Nestin-GFP 19 , 24 . La disponibilité des souris NG2-DsRed et la qualité de la plupart des anticorps NG2 limitent l'utilisation généralisée de cette méthode. Étant donné que tous les pericytes NG2 + expriment également le PDGFRβ dans les muscles squelettiques 19 , 20 , 24 , nous supposons que NG2 peut être remplacé par PDGFRβ pour l'isolement des pericytes et de leurs sous-populations. Ce travail décrit un protocole basé sur FACS quiUtilise la coloration PDGFRβ et le signal Nestin-GFP. Cette méthode est moins exigeante pour les chercheurs parce que: (1) il ne nécessite pas l'arrière-plan NG2-DsRed et (2) il utilise des anticorps PDGFRβ disponibles dans le commerce, qui sont bien caractérisés. En outre, il permet l'isolement simultané de pericytes de type I et de type II à haute pureté, ce qui permet d'approfondir la recherche sur la biologie et le potentiel thérapeutique de ces sous-populations de pericyte. Après la purification, ces cellules peuvent être cultivées en culture, et leurs morphologies peuvent être visualisées. Ce travail montre également que les pericytes de type I et de type II isolés en utilisant cette méthode, comme ceux purifiés à partir de souris doublement transgéniques, sont adipogènes et myogènes, respectivement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les pericytes sont des cellules perivasculaires multipotentes 22 , 23 situées sur la surface abluminal des capillaires 21 , 26 . Dans les muscles squelettiques, les pericytes peuvent se différencier selon les voies adipogènes et / ou myogènes 19 , 20 , 24 . Des études récentes ont révélé deux sous-popul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été partiellement soutenu par une subvention de Fund-A-Fellow de la Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) et la Subvention de développement scientifique de l'American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
Riferimenti
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