마우스 골격근에서 I 형과 II 형 Pericytes 분리
Summary
이 연구는 골격근에서 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포를 쉽고 동시에 격리 할 수있는 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
각질 세포는 여러 기관 또는 심지어 같은 조직 내에서 이질성을 나타내는 혈관 주변의 다 분화능 세포입니다. 골격근에는 여러 분자 마커를 표현하고 뚜렷한 분화능을 갖는 적어도 2 개의 일주 체형 하위 집단 (유형 I 및 유형 II라고 함)이 있습니다. NG2-DsRed 및 Nestin-GFP 이중 – 형질 전환 마우스를 사용하여, 유형 I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) 및 유형 II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) 혈관 주위 세포가 성공적으로 분리되었다. 그러나 이러한 double-transgenic mice의 유용성은이 정제 방법의 광범위한 사용을 방해합니다. 이 연구는 골격근으로부터 I 형 및 II 형 세포를 쉽고 동시에 분리 할 수있는 대체 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 형광 활성화 세포 정렬 (FACS) 기술을 이용하고 Nestin-GFP 신호와 함께 NG2보다는 PDGFRβ를 표적으로 삼습니다. 격리 후 I 및 ty를 입력하십시오.pe II 혈관 주위 세포는 별개의 형태를 나타낸다. 또한 이중 형질 전환 마우스에서 분리 된 것과 같은이 새로운 방법으로 분리 된 1 형 및 2 형 혈관 주위 세포는 각각 지방 형성 및 근육 형성이다. 이 결과는이 프로토콜이 골격근과 아마도 다른 조직으로부터 일주 전 세포 모집단을 분리하는데 사용될 수 있음을 시사한다.
Introduction
근이영양증은 지금까지 효과적인 치료법이없는 근육 퇴행성 장애입니다. 조직 재생을 촉진시키는 치료제 개발은 언제나 큰 관심사였습니다. 조직 재생 및 손상 후의 수리는 상주하는 줄기 세포 / 전구 세포에 달려 있습니다 1 . 위성 세포는 근육 재생 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7에 기여하는 근원 전구 세포입니다. 그러나 그들의 임상 적 사용은 주사 후 제한된 이동 및 낮은 생존율뿐만 아니라 시험관 내 증폭 8 , 9 , 10 , 11 후에 감소 된 분화능에 의해 방해 받는다. satelli 외에도te 세포에서 골격근은 또한 혈소판 유래 성장 인자 수용체 – 베타 (PDGFRβ) – 양성 간질 세포와 같은 근육 형성 잠재력이 12 , 13 , 14 , 15 , 16 인 많은 다른 세포 집단을 포함한다. 근육에서 파생 된 PDGFRβ + 세포가 근원 세포로 분화되어 근육 병리학 및 기능을 향상시킬 수 있다는 증거가있다 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ는 우세하게 혈관 주위 세포 인 다 혈관 주위 세포 21 을 나타냅니다. 22 , 23 . PDGFRβ 외에도 Neuron-Glial 2 (NG2) 및 CD146을 비롯한 많은 다른 마커가 i혈관 주위 세포를 확인하십시오 21 . 그러나 이들 마커 중 어느 것도 둘 다 pericyte-specific 21 이 아님을주의해야합니다. 최근 연구에 의하면 유형 I과 유형 II라고 불리는 근육 주변 세포의 두 가지 유형이 밝혀 졌는데, 이는 서로 다른 분자 표지를 나타내며 별개의 기능을 수행합니다 19 , 24 , 25 . 생화학 적으로, 유형 I 주변 세포는 NG2 + Nestin – 이고, 유형 II 주변 세포는 NG2 + Nestin + 19 , 24 이다. 기능적으로 유형 I의 세포주는 지방 축적 및 / 또는 섬유화에 기여하는 지방 형성 분화를 겪을 수 있지만 유형 II의 혈관 주위 세포는 근원적 인 경로를 따라 분화되어 근육 재생에 기여할 수있다 19 , 24 , 25 . 이러한 결과는 다음을 입증합니다 : (1) 유형 I 혈소판은 b지방 퇴행성 장애 / 섬유증의 치료를 목표로하는, 및 (2) II 형 혈관 주위 세포는 근이영양증에 대한 치료 가능성이 크다. 이러한 개체군에 대한 추가 조사와 특성 규명을 위해서는 높은 수준의 순도에서 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포의 분리를 가능하게하는 격리 프로토콜이 필요합니다.
현재, pericyte subpopulations의 고립은 NG2 – DsRed 및 Nestin – GFP 이중 transgenic 마우스 19 , 24 에 의존합니다. NG2-DsRed 생쥐의 유용성과 대부분의 NG2 항체의 품질은이 방법의 광범위한 사용을 제한합니다. 모든 NG2 + 혈관 주위 세포가 골격근 19 , 20 , 24 에서 PDGFRβ도 발현한다는 것을 감안할 때 우리는 혈관 주위 세포와 그 모집단의 분리를 위해 NG2가 PDGFRβ로 대체 될 수 있다고 가정한다. 이 작업은 FACS 기반 프로토콜을 설명합니다.PDGFRβ 염색 및 Nestin-GFP 신호를 사용합니다. 이 방법은 (1) NG2-DsRed 배경을 필요로하지 않으며 (2) 잘 특성화 된 상업적으로 이용 가능한 PDGFRβ 항체를 사용하기 때문에 조사자에게는 덜 까다로운 방법입니다. 또한 I 형과 II 형 혈관 주위 세포를 고순도로 동시에 분리 할 수있어 이러한 혈관 주위 세포 집단의 생물학적 특성과 치료 가능성을 연구 할 수 있습니다. 정화 후, 이들 세포는 배양 물에서 배양 될 수 있고, 그 형태는 시각화 될 수있다. 이 연구는 또한 이중 형질 전환 마우스에서 정제 된 것과 같은이 방법을 사용하여 분리 된 I 형 및 II 형 세포 주변 세포가 각각 지방 형성 및 근육 형성이라는 것을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
각질 세포는 모세 혈관 21 , 26 의 반 관절 표면에 위치한 다 능성 혈관 주위 세포 22 , 23 입니다. 골격근에서, 혈관 주위 세포는 지방 형성 및 / 또는 근원 형성 경로 19 , 20 , 24를 따라 분화 할 수 있습니다. 최근의 연구에 따르면 마커 발현이 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 근력 근이영양증 재단 (MDF-FF-2014-0013)의 기금 지원과 미국 심장 협회 (16SDG29320001)의 과학자 개발 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
Riferimenti
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