Выделение перицитов типа I и типа II из мышечных скелетных мышц
Summary
Эта работа описывает протокол на основе FACS, который позволяет легко и одновременно изолировать перициты типа I и типа II от скелетных мышц.
Abstract
Перициты являются периваскулярными мультипотентными клетками, которые проявляют гетерогенность в разных органах или даже в пределах одной и той же ткани. В скелетных мышцах есть по крайней мере две субпопуляции перицитов (так называемые тип I и тип II), которые экспрессируют различные молекулярные маркеры и обладают отличными возможностями дифференциации. С использованием двойных трансгенных мышей NG2-DsRed и Nestin-GFP успешно прошли выделение перициты типа I (NG2-DsRed + Nestin-GFP – ) и типа II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ). Однако доступность этих двойных трансгенных мышей предотвращает широкое использование этого метода очистки. Эта работа описывает альтернативный протокол, который позволяет легко и одновременно изолировать перициты типа I и типа II от скелетных мышц. Этот протокол использует технологию сортировки с активированной флуоресценцией клеток (FACS) и нацелен на PDGFRβ, а не NG2 вместе с сигналом Nestin-GFP. После изоляции введите I и tyПерициты пе II обладают отчетливыми морфологиями. Кроме того, перициты I и II типа, выделенные этим новым методом, как, например, выделенные из двойных трансгенных мышей, являются адипогенными и миогенными соответственно. Эти результаты позволяют предположить, что этот протокол может быть использован для выделения субпопуляций перицитов из скелетных мышц и, возможно, из других тканей.
Introduction
Мышечная дистрофия – дегенеративное расстройство мышц, которое пока не имеет эффективных методов лечения. Развитие терапии, способствующей регенерации тканей, всегда вызывало большой интерес. Регенерация и восстановление тканей после повреждения зависят от резидентных стволовых клеток / клеток-предшественников 1 . Сателлитные клетки представляют собой миогенные клетки-предшественники, которые способствуют регенерации мышц 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Их клиническое применение, однако, затруднено их ограниченной миграцией и низкой выживаемостью после инъекции, а также их пониженной способностью к дифференцировке после амплификации in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . В дополнение к спутникамTe клетки, скелетные мышцы также содержат много других клеточных популяций с миогенным потенциалом 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , таких как тромбоцитарные рецепторы-бета (PDGFRβ) -положительные интерстициальные клетки. Имеются данные, свидетельствующие о том, что полученные из мышцы PDGFRβ + клетки способны дифференцироваться в миогенные клетки и улучшать мышечную патологию и функцию 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ преимущественно обозначает перициты 21 , которые являются периваскулярными клетками с плюрипотентностью 22 , 23 . В дополнение к PDGFRβ, многие другие маркеры, включая Neuron-Glial 2 (NG2) и CD146, также используются для iУточнить перициты 21 . Следует отметить, однако, что ни один из этих маркеров не зависит от перицитов. 21 . Недавние исследования выявили два подтипа перицитов мышц, называемых типом I и типом II, которые экспрессируют различные молекулярные маркеры и выполняют различные функции 19 , 24 , 25 . Биохимически перициты I типа – NG2 + Nestin – , а перициты II типа – NG2 + Nestin + 19 , 24 . Функционально перициты I типа могут подвергаться адипогенной дифференцировке, способствуя накоплению жира и / или фиброзу, тогда как перициты II типа могут дифференцироваться вдоль миогенного пути, способствуя регенерации мышц 19 , 24 , 25 . Эти результаты показывают, что: (1) перициклы типа I могут bЕ, предназначенные для лечения жировых дегенеративных расстройств / фиброза, и (2) перициты II типа обладают большим терапевтическим потенциалом для мышечной дистрофии. Для дальнейшего изучения и характеристики этих популяций требуется протокол изоляции, который позволяет разделять перициты типа I и типа II с высоким уровнем чистоты.
В настоящее время выделение субпопуляций перицитов основано на двойных трансгенных мышах NG2-DsRed и Nestin-GFP 19 , 24 . Наличие мышей NG2-DsRed и качество большинства NG2-антител ограничивают широкое использование этого метода. Учитывая, что все NG2 + перициты также экспрессируют PDGFRβ в скелетных мышцах 19 , 20 , 24 , мы предполагаем, что NG2 можно заменить PDGFRβ для выделения перицитов и их субпопуляций. В этой работе описывается протокол на основе FACS, которыйИспользует окрашивание PDGFRβ и сигнал Nestin-GFP. Этот метод менее требователен для исследователей, поскольку: (1) он не требует фона NG2-DsRed и (2) он использует коммерчески доступные антитела PDGFRβ, которые хорошо охарактеризованы. Кроме того, он обеспечивает одновременную изоляцию перицитов типа I и типа II с высокой степенью чистоты, что позволяет провести дальнейшее изучение биологии и терапевтического потенциала этих субпопуляций перицитов. После очистки эти клетки можно выращивать в культуре, и их морфологии можно визуализировать. Эта работа также показывает, что перициты типа I и типа II, выделенные с использованием этого метода, подобно очищенным от двойных трансгенных мышей, являются адипогенными и миогенными соответственно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Перициты являются мультипотентными периваскулярными клетками 22 , 23 , расположенными на абляминальной поверхности капилляров 21 , 26 . В скелетных мышцах перициты способны дифференцироваться по адипогенным и / или миогенным …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана грантом Фонда-Фонда Фонда диетологии Myotonic Dystrophy (MDF-FF-2014-0013) и гранта на развитие науки от Американской кардиологической ассоциации (16SDG29320001).
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
Riferimenti
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
