Aislamiento de Pericitos Tipo I y Tipo II de Músculos Esqueléticos de Ratón
Summary
Este trabajo describe un protocolo basado en FACS que permite el aislamiento fácil y simultáneo de pericitos tipo I y tipo II de los músculos esqueléticos.
Abstract
Los pericitos son células multipotentes perivasculares que muestran heterogeneidad en diferentes órganos o incluso dentro del mismo tejido. En los músculos esqueléticos, existen al menos dos subpoblaciones pericíticas (llamadas tipo I y tipo II), que expresan diferentes marcadores moleculares y tienen distintas capacidades de diferenciación. Utilizando ratones doblemente transgénicos NG2-DsRed y Nestin-GFP, se han aislado con éxito los pericitos de tipo I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) y de tipo II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ). Sin embargo, la disponibilidad de estos ratones doblemente transgénicos impide el uso generalizado de este método de purificación. Este trabajo describe un protocolo alternativo que permite el aislamiento fácil y simultáneo de los pericitos tipo I y tipo II de los músculos esqueléticos. Este protocolo utiliza la técnica de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y objetivos PDGFR β, en lugar de NG2, junto con la señal de Nestin-GFP. Después del aislamiento, el tipo I y tyLos pericitos pe II muestran morfologías distintas. Además, los pericitos tipo I y II aislados con este nuevo método, como los aislados de los ratones doblemente transgénicos, son adipogénicos y miogénicos, respectivamente. Estos resultados sugieren que este protocolo puede usarse para aislar las subpoblaciones pericíticas de los músculos esqueléticos y posiblemente de otros tejidos.
Introduction
La distrofia muscular es un trastorno músculo-degenerativo que no tiene tratamientos efectivos hasta el momento. El desarrollo de terapias que promueven la regeneración tisular siempre ha sido de gran interés. La regeneración y reparación de los tejidos después del daño dependen de las células madre / células progenitoras residentes 1 . Las células satélite son células precursoras miogénicas comprometidas que contribuyen a la regeneración muscular 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Su uso clínico, sin embargo, se ve obstaculizado por su limitada migración y baja tasa de supervivencia después de la inyección, así como por su disminución de la capacidad de diferenciación después de la amplificación in vitro [ 8 , 9 , 10 , 11] . Además de satelliLos músculos esqueléticos también contienen muchas otras poblaciones celulares con potencial miogénico 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , tales como las células intersticiales positivas al receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGFRβ). Existen pruebas que demuestran que las células PDGFRβ + derivadas de los músculos son capaces de diferenciarse en células miogénicas y de mejorar la patología y la función muscular 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFR β predominantemente etiquetas pericitas 21 , que son las células perivasculares con pluripotencia [ 22 , 23] . Además de PDGFRβ, muchos otros marcadores, incluyendo Neuron-Glial 2 (NG2) y CD146, también se utilizan para iDentify pericytes 21 . Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que ninguno de estos marcadores es pericítico-específico [ 21] . Estudios recientes revelaron dos subtipos de pericitos musculares, denominados tipo I y tipo II, que expresan diferentes marcadores moleculares y realizan funciones distintas 19 , 24 , 25 . Bioquímicamente, los pericitos de tipo I son NG2 + Nestin – , mientras que los pericitos de tipo II son NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funcionalmente, los pericitos tipo I pueden experimentar diferenciación adipogénica, contribuyendo a la acumulación de grasa y / o fibrosis, mientras que los pericitos de tipo II pueden diferenciarse a lo largo de la vía miogénica, contribuyendo a la regeneración muscular 19 , 24 , 25 . Estos resultados demuestran que: (1) los pericitos de tipo I pueden bE dirigidos al tratamiento de trastornos degenerativos grasos / fibrosis, y (2) los pericitos tipo II tienen un gran potencial terapéutico para la distrofia muscular. Una mayor investigación y caracterización de estas poblaciones requiere un protocolo de aislamiento que permita la separación de los pericitos de tipo I y II con un alto nivel de pureza.
Actualmente, el aislamiento de las subpoblaciones de pericitos se basa en NG2-DsRed y Nestin-GFP doble-transgénicos ratones [ 19 , 24] . La disponibilidad de ratones NG2-DsRed y la calidad de la mayoría de los anticuerpos NG2 limitan el uso generalizado de este método. Dado que todos los pericitos NG2 + también expresan PDGFRβ en los músculos esqueléticos 19 , 20 , 24 , la hipótesis de que NG2 puede ser sustituido por PDGFR β para el aislamiento de los pericitos y sus subpoblaciones. Este trabajo describe un protocolo basado en FACS queUtiliza tinción PDGFRβ y la señal Nestin-GFP. Este método es menos exigente para los investigadores porque: (1) no requiere el fondo NG2-DsRed y (2) utiliza anticuerpos PDGFRβ comercialmente disponibles, que están bien caracterizados. Además, permite el aislamiento simultáneo de pericitos de tipo I y II con alta pureza, lo que permite investigar más a fondo la biología y el potencial terapéutico de estas subpoblaciones de pericitos. Después de la purificación, estas células se pueden cultivar en cultivo, y sus morfologías pueden visualizarse. Este trabajo también muestra que los pericitos tipo I y tipo II aislados utilizando este método, como los purificados a partir de ratones doblemente transgénicos, son adipogénicos y miogénicos, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pericitos son células perivasculares multipotentes 22 , 23 localizadas en la superficie abluminal de los capilares 21 , 26 . En los músculos esqueléticos, los pericitos son capaces de diferenciarse a lo largo de las vías adipogénicas y / o miogénicas 19 , 20 , 24 . Estudios recientes revelaron dos subp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado parcialmente por una beca del Fondo-A-Fellow de la Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) y la Beca de Desarrollo Científico de la American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
Riferimenti
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