Isolering av typ I och typ II pericyter från muskelsmuskler
Summary
Detta arbete beskriver ett FACS-baserat protokoll som möjliggör enkel och samtidig isolering av typ I och typ II pericytes från skelettmuskler.
Abstract
Pericytes är perivaskulära multipotenta celler som visar heterogenitet i olika organ eller till och med inom samma vävnad. I skelettmusklerna finns det minst två perikita subpopuleringar (kallad typ I och typ II), vilka uttrycker olika molekylmarkörer och har tydliga differentieringsegenskaper. Med hjälp av NG2-DsRed och Nestin-GFP dubbel-transgena möss har typ I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) och typ II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) pericytes isolerats framgångsrikt. Tillgängligheten av dessa dubbel-transgena möss förhindrar emellertid den utbredda användningen av denna reningsmetod. Detta arbete beskriver ett alternativt protokoll som möjliggör enkel och samtidig isolering av typ I och typ II pericytes från skelettmuskler. Detta protokoll använder den fluorescensaktiverade cellsorteringsmetoden (FACS) och riktar sig mot PDGFRβ, snarare än NG2, tillsammans med Nestin-GFP-signalen. Efter isolering, typ I och tyPe II pericytes visar olika morfologier. Dessutom är typ I och typ II-pericyter isolerade med denna nya metod, som de isolerade från de dubbel-transgena mössen, adipogena respektive myogena. Dessa resultat tyder på att detta protokoll kan användas för att isolera pericyte subpopulationer från skelettmuskler och eventuellt från andra vävnader.
Introduction
Muskeldystrofi är en muskel-degenerativ sjukdom som hittills inte har några effektiva behandlingar. Utvecklingen av terapier som främjar vävnadsregenerering har alltid varit av stort intresse. Vävnadsregenerering och reparation efter skada beror på hemma stamceller / stamceller 1 . Satellitceller är begåvade myogena precursorceller som bidrar till muskelregenerering 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Deras kliniska användning hindras emellertid av deras begränsade migration och låg överlevnad efter injektion, liksom av deras minskade differentieringsförmåga efter in vitro- amplifiering 8 , 9 , 10 , 11 . Förutom satellitTe-celler, skelettmuskler innehåller också många andra cellpopulationer med myogen potential 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , såsom blodplätt-härledda tillväxtfaktorreceptor-beta (PDGFRβ) -positiva interstitiella celler. Det finns bevis som visar att muskelavledda PDGFRβ + -celler kan differentiera till myogena celler och förbättra muskelpatologin och funktionen 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ övervägande märker pericytes 21 , vilka är perivaskulära celler med pluripotens 22 , 23 . Förutom PDGFRβ används också många andra markörer, inklusive Neuron-Glial 2 (NG2) och CD146, tillDentify pericytes 21 . Det bör dock noteras att ingen av dessa markörer är pericytspecifik 21 . Tidigare studier avslöjade två subtyper av muskelpericytor, kallad typ I och typ II, vilka uttrycker olika molekylmarkörer och utför separata funktioner 19 , 24 , 25 . Biokemiskt är typ I pericytor NG2 + Nestin – medan typ II pericytes är NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funktionellt kan typ I pericytes genomgå adipogen differentiering, vilket bidrar till fettackumulering och / eller fibros, medan typ II-pericytes kan differentiera längs den myogena vägen, vilket bidrar till muskelregenerering 19 , 24 , 25 . Dessa resultat visar att: (1) typ I pericytes kan bE riktade mot behandling av fettdegenerativa störningar / fibros och (2) typ II-pericyter har stor terapeutisk potential för muskeldystrofi. Ytterligare undersökning och karakterisering av dessa populationer kräver ett isoleringsprotokoll som möjliggör separering av typ I och typ II pericytes vid en hög renhetsgrad.
För närvarande är isoleringen av pericyte subpopuleringar beroende av NG2-DsRed och Nestin-GFP dubbel-transgena möss 19 , 24 . Tillgängligheten av NG2-DsRed-möss och kvaliteten på de flesta NG2-antikroppar begränsar den omfattande användningen av denna metod. Med tanke på att alla NG2 + pericytes också uttrycker PDGFRβ i skelettmusklerna 19 , 20 , 24 , förutser vi att NG2 kan ersättas med PDGFRβ för isoleringen av pericyter och deras subpopulationer. I det här arbetet beskrivs ett FACS-baserat protokoll somAnvänder PDGFRβ-färgning och Nestin-GFP-signalen. Denna metod är mindre krävande för utredare, eftersom: (1) den inte kräver NG2-DsRed-bakgrunden och (2) den använder kommersiellt tillgängliga PDGFRp-antikroppar, vilka är välkända. Dessutom möjliggör den samtidig isolering av typ I och typ II pericytes med hög renhet, vilket möjliggör ytterligare undersökning av biologiska och terapeutiska potentialen hos dessa pericyte subpopuleringar. Efter rening kan dessa celler odlas i odling och deras morfologier kan visualiseras. Detta arbete visar också att typ I och typ II-pericyter isolerade med användning av denna metod, som de som renats från dubbel-transgena möss, är adipogena respektive myogena.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pericyter är multipotenta perivaskulära celler 22 , 23 belägna på den abluminala ytan av kapillärerna 21 , 26 . I skelettmusklerna kan pericyter differentiera längs adipogena och / eller myogena vägarna 19 , 20 , 24 . Tidigare studier avslöjade två subpopulationer av pericytor, med olika marköruttryck …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av ett fond-A-stipendium från Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) och Scientific Development Grant från American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
Riferimenti
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
