근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩
Summary
활성 autophagy는 근육 줄기 세포 (MuSC) 활성화에 필수적인 생산적인 근육 재생과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 LC3의 현장 검출을위한 프로토콜을 제공합니다. LC3는 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편의 MyoD- 양성 MuSC에서의자가 작용 마커입니다.
Abstract
증가하는 증거는 조직 항상성을 보존하기위한 중요한 조절 과정으로서의 autophagy를 가리킨다. autophagy는 골격근 발달과 재생에 관여하며, autophagic 과정은 여러 가지 근육 병리학 및 연령 관련 근육 질환에 기술되어있는 것으로 알려져 있습니다. 근육 수리 중 위성 세포의 기능적 고갈과 관련이있는 최근에 설명 된 autophagic 과정의 블록은 활동적인 autophagy가 생산적인 근육 재생과 결합된다는 개념을지지합니다. 이 자료는 근이영양증과 같은 정상 및 병리학 적 조건 모두에서 근육 재생 중에 인공위성 세포 활성화에서의 autophagy의 중요한 역할을 밝힙니다. 여기, 우리는 근육 재생 조건 동안 성인 근육 줄기 세포 (MuSC) 구획에서 autophagic 과정을 모니터링하기위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 LC3의 현장 면역 형광 이미징을 수행하는 설치 방법을 설명합니다.utophagy 마커, MyoD, 근원 계통 마커를 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편에서 관찰 하였다. 보고 된 방법론은 근육 재생을 조율하는 데 중심적인 역할을하는 특정 세포 구획 인 MuSC 구획에서자가 식사 과정을 모니터링 할 수있게합니다.
Introduction
골격근 재생은 성체 줄기 세포 (Muscle Satellite Cells, MuSCs)와 재생 과정에 관여하는 다른 세포 유형 사이의 상호 작용의 결과입니다. 근육의 항상성과 기능은 근육 틈새와 전신 신호 1 , 2 에서 발생하는 결합 된 신호에 의해 유지됩니다. 평생 동안 MuSC 기능, 근육 틈새 및 체계적 단서의 변화가보고되어 고령자의 기능적 능력이 저하됩니다 3 . MuSC는 기저 층 아래의 틈새에 설치되며, 근육 손상시 손상된 근육을 복구하기 위해 활성화됩니다 4 , 5 . 생산적인 재생 반응을 보장하기 위해서는 MuSC가 정지, 자기 재생 및 증식 단계에서 벗어나는 데 필요한 여러 과정을 조정하는 것이 중요합니다근원적 인 차별화 6 . 노인과 근력 만성 질환에서 이러한 모든 기능이 손상되어 근육 기능이 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13으로 변경 됩니다.
Macroautophagy (이하 autophagy 라 함)는 조직의 항상성 유지에 필수적인 중요한 생물학적 과정으로 부상하고 있습니다. autophagic 과정은 세포질, 세포 소기관 및 단백질의 일부가 최종적으로 lysosome 경로를 통해 분해되어 독성 분자의 제거와 거대 분자의 재생을 촉진시키는 소포로 삼켜지는 인신 매매 (trafficking) 메커니즘을 포함합니다cules. 이것은 스트레스 나 다른 악조건 하에서 세포 및 조직 적응을 돕기 위해 에너지가 풍부한 화합물을 제공합니다 15 , 16 . 그것의 세포 생존 활동과 함께, autophagy는 또한 세포 조직 문맥 ( 예를 들면, 정상 조직 대 암 조직) 및 긴장 자극 17,18 의 유형에 따라서 세포 죽음 유도자로 작동 할 수있다.
최근의 증거에 따르면 autophagy는 근육 질량과 근육 섬유 무결성을 유지하는 데 필요하며 Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27을 비롯한 다양한 근이영양증 21 , 22 , 23 에서 장애가 있다고보고되었습니다 </su32 , 33 , 34 , 35 , 근육 질량의 감소 (sarcopenia라고도 함) 32 , 33 , 34 (p> , 28 , 29 , 30) 와 같은 노인에서 autophagic 과정의 점진적 감소가 관찰되었다. , 35 , 36 , 37 그리고 근전도 생존 38 .
autophagy와 골격 근육의 재생 잠재력 사이의 밀접한 관계는 Wagers 실험실의 연구에서 칼로리 제한이 MuSC 가용성과 활동을 향상 시킨다는 것을 보여주었습니다 39 . 이 아니오기능은 Foxo3-Notch 축이자가 재생 과정에서 자아 식 과정을 활성화시키고 MuSC가 정지 상태에서 증식 상태로 전환된다는 최근 관찰에 의해 뒷받침되었다. 이 데이터는 노화 동안 MuSC의 수치 적 및 기능적 감소와 관련하여 젊은에서 노인 및 노인 성인 MuSC 로의 기저 autophagy의 점진적인 감소와 일치한다.
최근 논문에서, 우리는 DMDF 진행의 초기 단계를 구별하는 보상 근육 재생과 autophagy 사이의 밀접한 관계를 증명했습니다. 따라서, 우리는 근육 재생이 손상되고 섬유화 조직 침착이 발생하는 질병 진행의 후기 단계에서 감소 된자가 연쇄 플럭스를 관찰했다. 흥미롭게도 우리는 재생 조건에서 autophagy가 MuSC에서 활성화되고, autophagic 과정을 조절하는 것이 MuSC 활성화 및 fu의무 30 .
종합적으로, 이러한 데이터는 정상 및 병리학 적 조건에서 그리고 수명 전반에 걸쳐 근육 재생 동안 MuSC에서 자이 필드 과정을 탐색 할 긴급 성을 강조한다. 여기에서 우리는 autophagy 43 의 마커 인 미세 소관 연합 단백질 1A / 1B-L 鎖 사슬 3 (LC3)과 MyoD의 마커 인 in situ immunostaining을 수행함으로써 근육 재생 조건에서 MuSC에서의 autophagic 과정을 모니터링하는 프로토콜을 제공합니다. myogenic 혈통, 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편에서. 보고 된 방법론은 근육 재생을 조율하는 데 핵심적인 역할을하는 특정 세포 구획 인 MuSC에서자가 식사 과정을 모니터링 할 수있게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 보상 근육 재생 중에 골격 근육 줄기 세포에서 autophagy를 모니터링하는 방법을 설명합니다. LC3와 MyoD의 공동 염색을위한 몇 가지 항체가 시도되었으며, 마우스 조직 절편에서 작동하고 성공적인 결과를 창출하는 항체가 여기에 나열되어 있습니다 ( 재료 표 참조). 성공적인 염색을 위해서는 메탄올로 투과성을 높이는 것이 좋습니다 (3.2.2 절 참조).
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIAMS AR064873, Epigen Project PB에서 지원되었습니다. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT에서 LL로
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
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