I situ Immunofluorescerande färgning av autophagy i muskelstamceller
Summary
Aktiv autofagi är förknippad med produktiv muskelregenerering, vilket är väsentligt för aktivering av muskelstamceller (MuSC). Här tillhandahåller vi ett protokoll för in situ- detektering av LC3, en autofagmarkör i MyoD-positiva MuSCs av muskelvävnadssektioner från kontroll och skadade möss.
Abstract
Ökande bevis pekar på autofag som en avgörande lagstiftningsprocess för att bevara vävnadshomeostas. Det är känt att autofagi är inblandad i utveckling av skelettmuskler och regenerering, och den autofagiska processen har beskrivits i flera muskelpatologier och åldersrelaterade muskelstörningar. Ett nyligen beskrivet block av den autofagiska processen som korrelerar med den funktionella uttömningen av satellitceller under muskelreparation stöder tanken att aktiv autofagi är kopplad till produktiv muskelregenerering. Dessa data avslöjar den avgörande rollen som autofagi vid satellitcellaktivering under muskelregenerering i både normala och patologiska tillstånd, såsom muskeldystrofi. Här tillhandahåller vi ett protokoll för att övervaka den autofagiska processen i det vuxna Muscle Stem Cell (MuSC) facket under muskelregenerativa förhållanden. Detta protokoll beskriver installationsmetoden för att utföra in situ immunofluorescensavbildning av LC3, en aUtofagy markör och MyoD, en myogen linjemarkör, i muskelvävnadssektioner från kontroll och skadade möss. Den rapporterade metoden möjliggör övervakning av den autofagiska processen i ett specifikt cellfack, MuSC-facket, som spelar en central roll vid orkestrerande muskelregenerering.
Introduction
Skelettmuskleregenerering är resultatet av interaktionen mellan vuxna stamceller (Muscle Satellite Cells, MuSCs) och andra celltyper som är involverade i regenerativ processen. Muskelhemostasis och funktionalitet upprätthålls av de kombinerade signalerna som härrör från muskelnischen och systemiska signalerna 1 , 2 . Under hela livet har förändringar i MuSC-funktionaliteten, muskelnischen och de systemiska signalerna rapporterats, vilket leder till minskningen av funktionell förmåga hos äldre 3 . MuSCs sätts i en nisch under basal lamina och, vid muskelskada, aktiveras för att reparera skadade muskler 4 , 5 . För att säkerställa ett produktivt regenerativt svar är det avgörande att MuSCs samordnar olika processer som är nödvändiga för utgången från vila, självförnyelsen och det proliferativa expansionssteget följtGenom myogen differentiering 6 . Hos äldre och muskulösa kroniska sjukdomar komprometteras alla dessa funktioner, vilket leder till förändrad muskelfunktionalitet 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Makroautofagi (här refererad till som autofag) framträder som en avgörande biologisk process som är väsentlig för att bevara vävnadshomostasis 14 . Den autofagiska processen omsluter smuggmekanismer, där delar av cytoplasma, organeller och proteiner sväller in i blåsor som i slutändan bryts ned via lysosomvägen, främjar avlägsnandet av toxiska molekyler och återvinning av makromolCules. Detta ger energirika föreningar för att stödja cell- och vävnadsanpassning under stress eller andra ogynnsamma tillstånd 15 , 16 . Tillsammans med sin cellöverlevnadsaktivitet kan autofag också fungera som en celldödsinducerare, beroende på cellvävnadssammanhang ( t ex normal mot cancervävnad) och typen av stressstimulans 17 , 18 .
Nya bevis tyder på att autofagi krävs för att upprätthålla muskelmassa och myofiberintegritet 19 , 20 och har rapporterats vara nedsatt i olika muskeldystrofi 21 , 22 , 23 , inklusive Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP> , 28 , 29 , 30. På samma sätt har en progressiv minskning av den autofagiska processen observerats hos äldre 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , efter en muskelmassa (hänvisad till som sarkopi) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 och i myofiberöverlevnad 38 .
Ett nära samband mellan autophagy och regenerativ potential av skelettmuskler förväntades av en studie från Wagers laboratorium, vilket visade att en kaloribegränsning förbättrar MuSC tillgänglighet och aktivitet 39 . Detta nrTion stöddes ytterligare av den senaste observationen att Foxo3-Notch-axeln aktiverar den autofagiska processen under självförnyelse 40 och MuSC-övergången från det vilande till det prolifererade tillståndet 41 . Dessa data överensstämmer med den progressiva minskningen av basal autophagy från unga till gamla och geriatriska MuSCs, i samband med den numeriska och funktionella nedgången av MuSCs under åldrandet 42 .
I en nyligen publicerad tidning visade vi ett nära samband mellan autofagi och kompensationsmuskleregenerering som särskiljer de tidiga stadierna av DMD-progression. Följaktligen observerades ett minskat autofagiskt flöde vid senare stadier av sjukdomsprogression, när muskelregenerering äventyras och fibrotisk vävnadsavsättning uppträder. Intrångsvis visade vi att vid regenereringsförhållanden aktiveras autophagy i MuSCs och den modulerande autofagiska processen påverkar MuSC-aktivering och fuNionalitet 30 .
Sammantaget lyfter dessa uppgifter upp det brådska att utforska den autofagiska processen i MuSCs under muskelregenerering under normala och patologiska förhållanden och under hela livslängden. Här tillhandahåller vi ett protokoll för att övervaka den autofagiska processen i MuSCs i muskelregenerativa betingelser genom att utföra in situ immunostaining för mikrotubulär associerad protein 1A / 1B-lätt kedja 3 (LC3), en markör för autophagy 43 och MyoD, en markör för Myogen härkomst, i muskelvävnadssektioner från kontroll och skadade möss. Den rapporterade metoden möjliggör övervakning av den autofagiska processen i ett specifikt cellfack, MuSC, som spelar en nyckelroll vid orkestrerande muskelregenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man övervakar autophagy i stamceller från skelettmuskel under kompensationsmuskleregenerering. Flera antikroppar för samfärgning av LC3 och MyoD försökades, och de som arbetar i musvävnadssektioner och skapar framgångsrika resultat finns här (se materialtabellen ). Permeabiliseringen med metanol (se steg 3.2.2) rekommenderas starkt för framgångsrik färgning.
Begränsningen av detta protokoll är kopplad till musens inneboende v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT till LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
Riferimenti
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
