In situ Immunofluorescente Staining of Autophagy in Spier Stamcellen
Summary
Actieve autofagie is geassocieerd met productieve spierregeneratie, die essentieel is voor het activeren van spierstamcellen (MuSC). Hier bieden we een protocol voor de in situ detectie van LC3, een autofagie marker in MyoD-positieve MuSCs van spierweefsel secties van controle en gewonde muizen.
Abstract
Toenemende bewijzen wijzen op autofagie als een cruciaal regulerend proces om weefsel homeostase te behouden. Het is bekend dat autofagie betrokken is bij ontwikkeling van de skeletspier en regeneratie, en het autofagische proces is beschreven in verscheidene spierpathologieën en leeftijdsgebonden spierstoornissen. Een recent beschreven blok van het autofagische proces dat correleert met de functionele uitputting van satellietcellen tijdens spierherstel ondersteunt het idee dat actieve autofagie gekoppeld is aan productieve spierregeneratie. Deze gegevens onthullen de cruciale rol van autofagie bij satellietcelactivering tijdens spierregeneratie in zowel normale als pathologische aandoeningen, zoals spierdystrofieën. Hier bieden we een protocol om het autofagische proces in het volwassen spierstamcel (MuSC) compartiment te monitoren tijdens spierregeneratieve condities. Dit protocol beschrijft de opzetmethode om in situ immunofluorescentie beeldvorming van LC3, een a uit te voerenUtophagy marker, en MyoD, een myogene afstammingsmarkering, in spierweefselsecties van controle en gewonde muizen. De gemelde methode maakt het mogelijk om het autofagische proces in een specifiek celcompartiment, het MuSC compartiment, te monitoren, dat een centrale rol speelt bij het regenereren van spieren.
Introduction
Skeletspierregeneratie is het gevolg van de interactie tussen volwassen stamcellen (Spier Satellietcellen, MuSCs) en andere celsoorten die betrokken zijn bij het regeneratieve proces. Spierhomeostase en functionaliteit worden gehandhaafd door de gecombineerde signalen die voortvloeien uit de spiernis en systemische cues 1 , 2 . Gedurende het hele leven zijn veranderingen in de MuSC-functionaliteit, de spiernis en de systemische signalen aangemeld, waardoor de functionele capaciteiten bij ouderen dalen 3 . MuSCs worden in een nis onder de basale lamina geplaatst en bij spierbesering geactiveerd om beschadigde spieren 4 , 5 te repareren. Om een productief regeneratief antwoord te waarborgen is het van cruciaal belang dat MuSCs verschillende processen coördineren die nodig zijn voor het verlaten van stilstand, de zelfvernieuwing en de proliferatieve expansie fase gevolgdDoor de myogene differentiatie 6 . Bij ouderen en bij spierchronische aandoeningen worden al deze functies gecompromitteerd, wat leidt tot gewijzigde spierfunctionaliteit 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Macroautophagy (hierna aangeduid als autofagie) komt tot uiting als een cruciaal biologisch proces dat essentieel is voor het behouden van weefsel homeostase 14 . Het autofagische proces omvat handelmeganismes, waarbij delen van cytoplasma, organellen en eiwitten in vesicles worden opgezwollen die uiteindelijk worden afgebroken via de lysosoomweg, het bevorderen van de verwijdering van toxische moleculen en de recycling van macromolecules. Dit biedt energie-rijke verbindingen om cel- en weefselaanpassing onder stress of andere ongunstige omstandigheden 15 , 16 te ondersteunen. Samen met de celoverlevingsactiviteit kan autofagie ook werken als een celdoodinducer, afhankelijk van de celweefselcontext ( bijv. Normaal versus kankerweefsel) en het type stressstimulus 17 , 18 .
Recent bewijzen wijzen erop dat autofagie nodig is om spiermassa en myofiberintegriteit 19 , 20 te behouden en is gerapporteerd te zijn in verschillende spierdystrofieën 21 , 22 , 23 , waaronder Duchenne Spierdystrofie (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP> , 28 , 29 , 30. Op dezelfde manier is een progressieve vermindering van het autofagische proces waargenomen bij ouderen 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , na verlies van spiermassa (aangeduid als sarcopenie) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 en in het overleven van myofiber 38 .
Een nauw verband tussen autofagie en het regeneratieve potentieel van skeletspieren werd verwacht door een studie van het laboratorium van Wagers, waaruit blijkt dat een caloriebeperking de beschikbaarheid en de activiteit van MuSC verhoogt 39 . Dit nrWerd verder ondersteund door de recente observatie dat de Foxo3-Notch-as het autofagische proces activeert tijdens zelfvernieuwing 40 en de MuSC-overgang van de rustende naar de prolifererende toestand 41 . Deze gegevens komen overeen met de geleidelijke vermindering van basale autofagie van jonge tot oude en geriatrische MuSCs, in samenhang met de numerieke en functionele afname van MuSC's tijdens veroudering 42 .
In een recent document bleek een nauwe relatie tussen autofagie en de compenserende spierregeneratie die de vroege stadia van DMD-progressie onderscheidt. Bijgevolg observeerden we een verminderde autofagische flux bij latere stadia van de ziekteprogressie, wanneer spierregeneratie gecompromitteerd is en fibrotische weefselafzetting optreedt. Opvallend, we hebben aangetoond dat bij regenererende omstandigheden autofagie geactiveerd wordt in MuSCs en dat het moduleren van het autofagische proces invloed heeft op MuSC-activering en fuNctionaliteit 30 .
Al deze gegevens duiden de urgentie op om het autofagische proces in MuSCs te onderzoeken tijdens spierregeneratie tijdens normale en pathologische omstandigheden en gedurende de levensduur. Hier voorzien we in een protocol om het autofagische proces in MuSCs te controleren in spierregeneratieve condities door in situ immunostaining voor microtubule-geassocieerde eiwit 1A / 1B-lichte keten 3 (LC3), een marker van autofagie 43 en MyoD, een marker van Myogene afstamming, in spierweefselsecties van controle en gewonde muizen. De gemelde methode maakt het mogelijk om het autofagische proces in een specifiek celcompartiment, de MuSC, te monitoren, die een sleutelrol speelt bij het regenereren van spieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe autofagie in stamcellen van de skeletspier wordt gecontroleerd tijdens compenserende spierregeneratie. Verscheidene antilichamen voor het co-stainen van LC3 en MyoD werden geprobeerd, en degenen die in muisweefselafdelingen werken en succesvolle resultaten opleveren, worden hier vermeld (zie Materialtabel ). De permeabilisatie met methanol (zie stap 3.2.2) wordt sterk aanbevolen voor succesvolle kleuring.
De beperking van dit protocol is gek…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT naar LL
Materials
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
Riferimenti
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs?. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
