Combinatie van Raman Imaging en Multivariate Analysis om Lignine, Cellulose en Hemicellulose in de Plant Cell Wall te visualiseren

Summary

Dit protocol beoogt een algemene methode te presenteren om lignine, cellulose en hemicellulose in plantencelwanden te visualiseren met behulp van Raman imaging en multivariate analyse.

Abstract

De toepassing van Raman imaging op plantaardige biomassa neemt toe omdat het ruimtelijke en compositie-informatie over waterige oplossingen kan bieden. De analyse vereist gewoonlijk niet uitgebreide monstervoorbereiding; Structurele en chemische informatie kan worden verkregen zonder etikettering. Echter, elke Raman-afbeelding bevat duizenden spectra; Dit leidt tot problemen bij het opnemen van verborgen informatie, vooral voor componenten met vergelijkbare chemische structuren. Dit werk introduceert een multivariate analyse om dit probleem aan te pakken. Het protocol stelt een algemene methode in voor het visualiseren van de hoofdcomponenten, waaronder lignine, cellulose en hemicellulose binnen de plantencelwand. In dit protocol worden procedures voor steekproefbereiding, spectrale aanschaf en dataverwerking beschreven. Het is sterk afhankelijk van de vaardigheden van de operator bij het voorbereiden van de monster- en data-analyse. Met behulp van deze aanpak kan een Raman-onderzoek worden uitgevoerd door een niet-gespecialiseerde gebruiker om hig te verwervenH-kwaliteitsdata en zinvolle resultaten voor plantencelwandanalyse.

Introduction

Plant biomass is the most abundant renewable resource on Earth; is mainly composed of lignin, cellulose, and hemicellulose; and is considered an attractive source of bioenergy and bio-based chemicals¹. Unfortunately, it can resist degradation and confer hydrolytic stability or structural robustness to the plant cell wall. Such resistance is attributable to the accessible surface area, biomass particle size, degree of polymerization, cellulose crystallinity, and protective lignin². A comprehensive understanding of the structural and chemical nature of the plant cell wall is thus significant from the viewpoint of plant biology and chemistry, as well as from that of commercial utilization. Commonly used wet chemistry analyses, such as chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy, only provide average compositional data of the measured sample. Furthermore, these methods are invasive and destroy the original structure of the plant tissue³.

The Raman imaging technique is a powerful tool for the nondestructive visualization of spatially resolved chemical information⁴. It uses a laser light to cause inelastic scattering with a photon and relies on changes in polarizability arising from the molecular vibrations. In this case, water causes weak Raman scattering, which makes this approach suitable for in situ investigations of biological samples⁵. The application of the Raman imaging technique to the plant cell wall can elucidate the structure and composition of plant cell walls in their native state, with the resolution on the scale of the single cell and even of the cell wall layers⁶. A typical Raman imaging analysis of a plant cell wall generally consists of three steps: 1) sample preparation, 2) spectral acquisition, and 3) data processing.

Although one of the major advantages of Raman imaging is the ability to achieve label-free and non-destructive spectra with minimal sample preparation, physical sample sectioning is still necessary to expose the surface of interest. This process should be performed carefully to obtain a flat surface, since the technique depends on maintaining optical focus⁷. Spectral acquisition requires a balance between image quality and extensive acquisition times⁸. Data processing aims to effectively extract the chemical information from the image data, especially for the components with similar chemical structures, such as cellulose and hemicellulose. Due to the strong spectral overlap, the exact spectra are difficult to discern. In this case, multivariate analysis is a straightforward approach to effectively uncover the hiding structural and chemical information⁹. This work presents a general protocol describing the use of Raman imaging to visualize the main components in plant cell walls, including lignin, cellulose, and hemicellulose.

Protocol

1. Voorbeeld Bereiding Knip een klein weefselblok (ongeveer 3 mm x 3 mm x 5 mm) van het plantenmonster af ( bijvoorbeeld een populierstam). Dompel het weefsel gedurende 30 minuten in kokend gedeïoniseerd water. Breng het onmiddellijk naar gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 minuten. Herhaal deze stap totdat het weefsel zinkt naar de bodem van de container, wat aangeeft dat de lucht in weefsel is verwijderd en dat het weefsel is verzacht. Opmerking: Voor de mo…

Representative Results

Figuur 1 geeft een overzicht van een typisch micro-Raman systeem voor de Raman beeldvorming van een plantencelwand. Bijvoorbeeld, de oorspronkelijke Raman spectra van populier ( Populus nigra L.) hebben significante baseline drijvingen en spikes ( Figuur 2a ). Na het uitvoeren van de automatische voorverwerkingsmethode voor Raman imaging dataset (APRI) worden deze twee spectrale verontreinigingen succesvol verwijderd ( …

Discussion

De plantencelmuur is een samengesteld materiaal dat in verschillende lagen is georganiseerd, inclusief celhoek (CC), secundaire muur (SW, met de S1, S2 en S3 lagen), en samengestelde midden lamella (CML, midden lamella plus de aangrenzende primaire Muur), waardoor het moeilijk is om een ​​platte oppervlakte te verkrijgen tijdens de monstervoorbereiding. Zo moeten plantmonsters, in het bijzonder gras, die een ingewikkelder structuur hebben dan hout, vaak worden gestolven om fijne snede te kunnen maken. PEG is een ide…

Materials

Microtome	Thermo Scientific	Microm HM430
Confocal Raman microscope	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040