Kombinera Raman Imaging och Multivariate Analysis för att visualisera Lignin, Cellulosa och Hemicellulosa i växtcellsväggen

Summary

Detta protokoll syftar till att presentera en allmän metod för att visualisera lignin, cellulosa och hemicellulos i växtcellsväggar med användning av Raman-bildbehandling och multivariatanalys.

Abstract

Applikationen av Raman imaging till växtbiomassa ökar eftersom den kan erbjuda rumslig och kompositionell information om vattenhaltiga lösningar. Analysen kräver vanligtvis inte omfattande provberedning; Strukturell och kemisk information kan erhållas utan märkning. Varje Raman-bild innehåller emellertid tusentals spektra; Detta ger upphov till svårigheter när man extraherar dold information, speciellt för komponenter med liknande kemiska strukturer. Detta arbete introducerar en multivariatanalys för att lösa problemet. Protokollet fastställer en allmän metod för att visualisera huvudkomponenterna, inklusive lignin, cellulosa och hemicellulosa i växtcellsväggen. I detta protokoll beskrivs procedurer för provframställning, spektralförvärv och databehandling. Det är högt beroende av operatörskunskap vid provberedning och dataanalys. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan en Raman-undersökning utföras av en icke-specialiserad användare att förvärva higH-kvalitetsdata och meningsfulla resultat för analys av växtcellväggar.

Introduction

Plant biomass is the most abundant renewable resource on Earth; is mainly composed of lignin, cellulose, and hemicellulose; and is considered an attractive source of bioenergy and bio-based chemicals¹. Unfortunately, it can resist degradation and confer hydrolytic stability or structural robustness to the plant cell wall. Such resistance is attributable to the accessible surface area, biomass particle size, degree of polymerization, cellulose crystallinity, and protective lignin². A comprehensive understanding of the structural and chemical nature of the plant cell wall is thus significant from the viewpoint of plant biology and chemistry, as well as from that of commercial utilization. Commonly used wet chemistry analyses, such as chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy, only provide average compositional data of the measured sample. Furthermore, these methods are invasive and destroy the original structure of the plant tissue³.

The Raman imaging technique is a powerful tool for the nondestructive visualization of spatially resolved chemical information⁴. It uses a laser light to cause inelastic scattering with a photon and relies on changes in polarizability arising from the molecular vibrations. In this case, water causes weak Raman scattering, which makes this approach suitable for in situ investigations of biological samples⁵. The application of the Raman imaging technique to the plant cell wall can elucidate the structure and composition of plant cell walls in their native state, with the resolution on the scale of the single cell and even of the cell wall layers⁶. A typical Raman imaging analysis of a plant cell wall generally consists of three steps: 1) sample preparation, 2) spectral acquisition, and 3) data processing.

Although one of the major advantages of Raman imaging is the ability to achieve label-free and non-destructive spectra with minimal sample preparation, physical sample sectioning is still necessary to expose the surface of interest. This process should be performed carefully to obtain a flat surface, since the technique depends on maintaining optical focus⁷. Spectral acquisition requires a balance between image quality and extensive acquisition times⁸. Data processing aims to effectively extract the chemical information from the image data, especially for the components with similar chemical structures, such as cellulose and hemicellulose. Due to the strong spectral overlap, the exact spectra are difficult to discern. In this case, multivariate analysis is a straightforward approach to effectively uncover the hiding structural and chemical information⁹. This work presents a general protocol describing the use of Raman imaging to visualize the main components in plant cell walls, including lignin, cellulose, and hemicellulose.

Protocol

1. Provberedning Skär ett litet vävnadsblock (ca 3 mm x 3 mm x 5 mm) från växtprovet ( t.ex. en poppelstam). Doppa vävnaden i kokande avjoniserat vatten under 30 minuter. Överför det omedelbart till avjoniserat vatten vid rumstemperatur (RT) i 30 minuter. Upprepa detta steg tills vävnaden sjunker till botten av behållaren, vilket indikerar att luften i vävnad har tagits bort och att vävnaden har mjukat. Obs! För de prover som sjunker till botten före detta steg, upprepa …

Representative Results

Figur 1 ger en översikt över ett typiskt mikro-Raman-system för Raman-avbildning av en växtcellsvägg. Som ett exempel har de ursprungliga pilanspektrarna av poplar ( Populus nigra L.) signifikanta baslinjedrifter och spikar ( Figur 2a ). Efter att ha utfört den automatiska förbehandlingsmetoden för Raman imaging data set (APRI), elimineras dessa två spektrala föroreningar framgångsrikt ( …

Discussion

Växthusväggen är en komposit som är organiserad i flera lager, inklusive cellhörn (CC), sekundärvägg (SW, med S1, S2 och S3-skikten) och sammansatta mittskivor (CML, mitt lamell plus angränsande primär Vägg), vilket gör det svårt att erhålla en plan yta under provberedningen. Således måste växtprover, särskilt gräs, som har en mer komplicerad struktur än trä, ofta stelna för att möjliggöra fin snittning. PEG är en idealisk hårdmatris för skärning och Raman-undersökning, eftersom den är lösl…

Materials

Microtome	Thermo Scientific	Microm HM430
Confocal Raman microscope	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040