Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie
Summary
Diese Arbeit beschreibt die Standardisierung eines Verfahrens, um gereinigte Keimzellpopulationen aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten zu erhalten. Es ist ein einfaches Protokoll, das mechanische Hodendissoziation, Färbung mit Hoechst-33342 und Propidiumjodid und FACS-Sortierung kombiniert, mit breiten Anwendungen in vergleichenden Studien der männlichen Fortpflanzungsbiologie.
Abstract
Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) war eine der Methoden der Wahl, um angereicherte Populationen von Säugetier-Hoden-Keimzellen zu isolieren. Derzeit ermöglicht es die Unterscheidung von bis zu 9 murinen Keimzellpopulationen mit hoher Ausbeute und Reinheit. Diese hochauflösende Diskriminierung und Reinigung ist durch einzigartige Veränderungen der Chromatinstruktur und -menge in der gesamten Spermatogenese möglich. Diese Muster können durch Durchflusszytometrie von männlichen Keimzellen erfasst werden, die mit fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoffen wie Hoechst-33342 (Hoechst) gefärbt sind. Hierin ist eine detaillierte Beschreibung eines kürzlich entwickelten Protokolls zur Isolierung von Hodenzellen von Säugetieren. Kurz gesagt werden Einzelzellsuspensionen aus dem Hodengewebe durch mechanische Dissoziation erzeugt, mit Hoechst und Propidiumjodid (PI) doppelt gefärbt und durch Durchflusszytometrie verarbeitet. Eine serielle Gating-Strategie, einschließlich der Auswahl von lebenden Zellen (PI-negativ) mit unterschiedlichem DNA-Gehalt (Hoechst-Intensität), iS verwendet während der FACS-Sortierung, um bis zu 5 Keimzelltypen zu unterscheiden. Hierbei handelt es sich um entsprechende durchschnittliche Reinheiten (bestimmt durch mikroskopische Auswertung): Spermatogonien (66%), primäre (71%) und sekundäre (85%) Spermatozyten und Spermatiden (90%), weiter getrennt in runde (93%) und verlängert (87%) Subpopulationen. Die Ausführung des gesamten Workflows ist einfach, ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von 4 Zelltypen mit der entsprechenden FACS-Maschine und kann in weniger als 2 h durchgeführt werden. Da eine reduzierte Verarbeitungszeit entscheidend für die Erhaltung der Physiologie von ex vivo- Zellen ist, eignet sich diese Methode ideal für nachgeschaltete Hochdurchsatz-Studien der männlichen Keimzellbiologie. Darüber hinaus eliminiert ein standardisiertes Protokoll für die Multispezies-Reinigung von Säugetierkeimzellen methodische Quellen von Variablen und ermöglicht es, einen einzelnen Satz von Reagenzien für verschiedene Tiermodelle zu verwenden.
Introduction
Angesichts des Mangels an In-vitro- System, das für die Spermatogenese-Progression repräsentativ ist, und die Anwesenheit einer großen zellulären Heterogenität im Hoden, erforschen die Studien der männlichen Keimzellbiologie robuste Techniken, um angereicherte Populationen spezifischer Zelltypen zu isolieren. Die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) wurde zu diesem Zweck 1 , 2 , 3 , 4 , 5 weit verbreitet , da sie eine hohe Ausbeute und Reinheit liefert und andere Isolationsverfahren in der Anzahl der Keimzelltypen übertrifft, die sie identifizieren können Wählen Sie 6 , 7 , 8 . Das Prinzip der Durchflusszytometrieanalyse basiert auf der Erkennung von Differenzlichtmustern nach der Laserstrahlanregung einzelner Zellen. Als eine Zelle durch den Laser geht es reflektiert / streut LichtIn allen Winkeln, proportional zur Zellgröße (Vorwärtsstreuung, FSC) und zur intrazellulären Komplexität (Seitenstreuung, SSC). Siehe Ormerod 9 für detaillierte Informationen zur Durchflusszytometrie.
Männliche Keimzellen unterliegen spezifischen Modifikationen des DNA-Gehalts, der Chromatinstruktur, der Größe und der Form in verschiedenen Stadien der Spermatogenese. So können unterschiedliche Zellpopulationen identifiziert und durch Kombination von Lichtstreuung und DNA-Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen 10 , 11 getrennt werden . Hierzu können mehrere Farbstoffe verwendet werden (siehe Geisinger und Rodriguez-Casuriaga 3 ), wie zB Hoechst-33342 (Hoechst), die häufig in der Durchflusszytometrieanalyse von Hodenzellen für die letzten zehn Jahre 1 , 2 , 4 , 10 verwendet wurde , 12 AufN Anregung mit UV-Licht, Hoechst emittiert blaue Fluoreszenz proportional zum zellulären DNA-Gehalt, während weit rote Fluoreszenz die Variabilität der Chromatinstruktur und der Verdichtung 1 , 13 , 14 widerspiegelt. Als Ergebnis zeigen männliche Keimzellen in verschiedenen Stufen der Differenzierung spezifische Muster während FACS von Hoechst-gefärbten Einzelzellsuspensionen (Ho-FACS, 1 , 12 ). Interessanterweise ist die Intensität der Hoechst-Blau-Fluoreszenz aufgrund eines Mechanismus des Farbstoff-Efflux, der nur während des Spermatogonialstadiums aktiv ist, nicht proportional zum Chromatingehalt in diesen Zellen, und sie gruppieren sich als Seitenpopulation während Ho-FACS 15 . Darüber hinaus ermöglicht die Kombination von Hoechst-Färbung mit dem nicht-permeierenden Farbstoff Propidiumjodid (PI) den Anwendern, lebende (PI-negative) von toten (PI-positiven) Zellen während FACS 1 <zu unterscheidenSup>, 2 , 10 , 12 . Diese Strategie wurde bisher in Durchflusszytometrieanalysen von Hodenkeimzellen verwendet und weitgehend in der Maus optimiert, um bis zu 9 Keimzelltypen, einschließlich Zellen in 4 verschiedenen Stadien der Meiose I 1 , 2 , 4 , 16 zu unterscheiden . Für die Zwecke dieser Arbeit hat Hoechst Färbung drei Hauptvorteile. Zuerst wurde Ho-FACS erfolgreich auf die Isolierung von männlichen Keimzellen im Mausmodell 1 , 2 , 12 und anderen Nagetieren wie Ratte und Meerschweinchen 17 , 18 , 19 angewendet. Zweitens ist Hoechst ein Zell-Permeations-Farbstoff und erfordert keine Membran-Permeabilisierung, so dass es preserVes Zelle Integrität. Schließlich ist keine RNase-Behandlung erforderlich, da Hoechst bevorzugt Poly (d [AT]) DNA-Sequenzen 1 , 20 bindet, was bedeutet, dass RNA konserviert wird und zusätzlich zu DNA und Proteinen für weitere nachgeschaltete molekulare Studien von Keim verwendet werden kann Zelldifferenzierung.
Trotz der Ähnlichkeit der DNA-Ploidie und / oder der Färbbarkeit, die bei Durchflusszytometrie-Analysen von Säugetierarten beobachtet wurde (in Geisinger und Rodriguez-Casuriaga 3 untersucht ), gab es in den für die männliche Keimzellisolation durch Durchflusszytometrie beschriebenen Protokolle viel Variabilität. Verschiedene Studien haben spezifische Protokolle für die Gewebe-Dissoziation verwendet und verwendeten unterschiedliche DNA-bindende Farbstoffe (allein oder in Kombination) und FACS-Gating-Strategien in verschiedenen Modellorganismen, hauptsächlich der Maus, Ratte und Meerschweinchen. Daher kann der direkte Vergleich der für verschiedene Arten gesammelten Daten durch Unacco beeinflusst werdenUnzureichende technische Artefakte, die sich aus der Variabilität zwischen den Methoden ergeben. Wichtig ist, dass die markante Konservierung der Chromatin-Dynamik während der Säugetier-Spermatogenese (2N-4N-2N-1N) darauf hindeutet, dass ein standardisiertes Protokoll quer auf eine Vielzahl von Säugetierarten angewendet werden könnte.
Das Ziel dieser Studie war es, einen einzigen Workflow zu entwickeln, der für verschiedene Säugetierarten anwendbar ist, indem er die bisher veröffentlichten Techniken 2 , 20 kombiniert und anpasst. Standardisierung eines Verfahren zur Gewebeverarbeitung wurde durch Durchführen mechanische Dissoziation zu überwinden , die Notwendigkeit für speziesspezifische Anpassungen erforderlich , für die enzymatische Verdauung 5 erreicht. Es ist bemerkenswert, dass eine mechanische Dissoziation von Nagetier-Hodengewebe gezeigt wurde, dass sie besser als die enzymatische Gewebsverdauung 20 und Ho-FACS von Einzelzell-Suspensionen, die durch beide Verfahren erzeugt wurden, ausführenEs vergleichbare Ergebnisse 5 . Als Beweis für das Prinzip beschreibt dieses Protokoll die Einstellungen, die verwendet werden, um bis zu 5 Keimzellpopulationen zu isolieren: Spermatogonie (SPG); Primäre (SPC I) und sekundäre Spermatozyten (SPC II) und Spermatiden (SPD) – rund (rSPD) und verlängert (eSPD). Wichtig ist, dass es einfach im Labor zu implementieren ist, wobei die Hauptanforderungen das System für die Gewebedissoziation und den Zugang zu einem Zellsortierer sind, der mit einem UV-Laser ausgestattet ist. Dieser Workflow ( Abbildung 1 ) ist schnell und unkompliziert und ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von 4 Keimzellpopulationen aus frischem Hodengewebe in weniger als 2 h. Die reduzierte Verarbeitungszeit ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der zellularen Integrität für weitere nachgeschaltete Verfahren. Darüber hinaus deutet die erfolgreiche Aufführung in 5 verschiedenen Spezies darauf hin, dass es in der Säugetier-Clade weitgehend angewendet werden kann. Damit ist es die ideale Methode, um Keimzellen für Vergleichsstudien von männlichen männlichen Fortpflanzungsbiolen zu untersuchenOgy
Dieses Protokoll besteht aus drei Hauptabschnitten, abgesehen von den vorbereitenden Schritten: (1) der mechanischen Dissoziation von Hodengewebe und (2) Färbung von Hodenzellen mit Hoechst und PI, gefolgt von (3) FACS-Sortierung relevanter spermatogener Zellen. Sobald gesammelt, können diese angereicherten Populationen von verschiedenen Säugetier-Hoden-Keimzellen für eine breite Palette von Anwendungen verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt eine "one-size fits all" Dissoziationsmethode, um männliche Keimzellen aus vielen verschiedenen Säugetierarten zu reinigen. Abhängig von der Art der Studie, die die Benutzer mit den isolierten Keimzellen durchführen möchten, können andere Medien oder Puffer verwendet werden. Die folgenden Protokollschritte sind für die Erzeugung von Einzelzell-Suspensionen aus einem ganzen Mäuse-Testis.
Protocol
Representative Results
Discussion
In Anbetracht der hochkonservierten Chromatin-Dynamik bei der Spermatogenese bei Säugetieren war das Ziel dieser Arbeit, ein Protokoll zu entwickeln, um männliche Keimzellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung von verschiedenen Säugetier-Hodengeweben zu isolieren ( Abbildung 1 ). Eines der größten Hindernisse bei der Anwendung eines einzelnen Workflows auf verschiedene Tiermodelle ist die Notwendigkeit von Spezies-spezifischen Anpassungen, insbesondere in Bezug auf Gewebe-Diss…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) für Hundehunde; Jason Arand und Dr. Ted Cicero's Labor an der Washington University in St. Louis (WashU) für die Bereitstellung von Ratten-Testes und Brianne Tabers für die Unterstützung der Sammlung; Jared Hartsock und Dr. Salt's Lab bei WashU für die Meerschweinchen-Hoden; Und Dr. Michael Talcott in der Abteilung für Vergleichende Medizin bei WashU für die Mini-Schweine-Hoden. Die Autoren bestätigen auch das Alvin J. Siteman Cancer Center an der Washington University School of Medicine und dem Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, für den Einsatz des Siteman Flow Cytometry Core, der mit dem Personal betriebenen Zellsortierdienst ausgestattet war. Das Siteman Cancer Center wird teilweise unterstützt von NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.
Diese Forschung wurde von einem FCT-Doktorandenstipendium [SFRH / BD / 51695/2011 an ACL] finanziert, gewährt von den United States National Institutes of Health [R01HD078641 und R01MH101810 bis DFC] und einem FCT-Forschungsvertrag [IF / 01262/2014 bis AML].
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
Riferimenti
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. ‘Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
