Qui descriviamo un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione dei vettori retrovirali basati su virus della leucemia murina Moloney nelle cellule umane.
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Articolo metodologico
Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule
In questo articolo
Sommario
Abstract
I vettori retrovirali a base virale di leucemia murina Moloney (MLV) si integrano prevalentemente in promotori e promotori acetilati. Per questo motivo, i siti di integrazione di mLV possono essere utilizzati come marcatori funzionali di elementi regolatori attivi. Qui presentiamo uno strumento di scansione retrovirale, che consente la identificazione genica di promotori e promotori specifici delle cellule. In breve, la popolazione di cellule bersaglio viene trasdotta con un vettore derivato da mLV e il DNA genomico viene digerito con un enzima di restrizione a taglio frequente. Dopo la legatura di frammenti genomici con un linker DNA compatibile, la reazione a catena di polimerasi mediata da linker (LM-PCR) consente l'amplificazione dei giunti del genoma del virus-ospite. La sequenza massiccia degli ampliconi viene utilizzata per definire il profilo di integrazione mLV in tutto il genoma. Infine, sono definiti cluster di integrazioni ricorrenti per identificare regioni regolatori specifiche per le cellule, responsabili dell'attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare.
ad esempio cellule staminali somatiche) che non dispongono di marcatori robusti per l'isolamento prospettico.
Introduzione
L'identità cellulare è determinata dall'espressione di set specifici di geni. Il ruolo degli elementi cis-regolatori, come promotori e promotori, è fondamentale per l'attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare. Queste regioni regolatrici sono caratterizzate da caratteristiche specifiche di cromatina, quali modificazioni peculiari dell'istone, fattori di trascrizione e co-fattori legati e accessibilità cromatica, che sono stati ampiamente utilizzati per la loro identificazione a livello genomico in diversi tipi di cellule 1 , 2 , 3 . ....
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Protocollo
1. MLV Trasduzione di cellule umane
- Isolare le cellule bersaglio e trasportarle con un vettore retrovirale derivato da mlV che ospita il gene del reporter eGFP e pseudotipizzato con vescicolare Stomatite Virus G (VSV-G) o la glicoproteina dell'amfotropo 16 .
- Tenere le cellule mock transduced come un controllo negativo per le analisi seguenti. Poiché i vettori retrovirali basati su mLV possono trasducere cellule divide in modo efficiente, coltivare la popolazione delle cellule bersaglio in condizioni che stimolano la divisione cellulare. Le condizioni di trasduzione devono essere specificamente ottimizza....
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Risultati
Flusso di lavoro della procedura di scansione retrovirale
Il flusso di lavoro della procedura di scansione retrovirale è schematizzato in Figura 1 . La popolazione delle cellule bersaglio viene purificata e trasfusa con un vettore retrovirale derivato da mLV che esprime un gene reporter del eGFP. Il transgene è affiancato dalle due identiche ripetizioni terminali lunghe (5 'e 3' LTR), garante.......
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Discussione
Qui abbiamo descritto un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione di mLV, un retrovirus che mira alle regioni di cromatina, contrassegnato epigeneticamente come promotori e promotori attivi. I passi critici e / o le limitazioni del protocollo includono: (i) trasduzione mLV della popolazione cellulare target; (Ii) amplificazione di giunzioni virali-host da parte di LM-PCR; (Iii) recupero di un'alta percentuale di siti di integrazione. I vettori retrovirali basati su mLV trasudano in modo efficien.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), Ministero italiano dell'istruzione, delle università e della ricerca (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), il Ministero della Salute italiano (Giovani ricercatori Chiamata 2011 GR-2011-02352026) e la Fondazione Imagine Institute (Parigi, Francia).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | o equivalente |
| Siero fetale bovino | ThermoScientific | 16000044 | o equivalente |
| Provette da 0,2 ml | fornitore | ||
| Provette da 1,5 ml | di laboratorio | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | o equivalente |
| T4 DNA ligasi | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligasi Tampone di reazione | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Filamento oligonucleotide | fornitore | di laboratorio 5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' (Grado di purificazione: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | generale di laboratorio | 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Grado di purificazione: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerasi Alta Fedeltà | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | o acqua di |
| grado PCR | laboratorio generale | ||
| ciclatore termico a 96 pozzetti (con coperchio riscaldato) | fornitore | ||
| primer linker | di laboratorio | 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Grado di purificazione: grado PCR) | |
| MLV-3' Primer LTR | di laboratorio generale | 5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Grado di purificazione: grado PCR) | |
| linker nested primer 454 | di laboratorio generale | 5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grado di purificazione: SDS-PAGE) | |
| MLV-3' LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grado di purificazione: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTGAGAGAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grado di purificazione: SDS-PAGE) | |
| MLV-3' Primer nidificato LTR Illumina | di laboratorio generale | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grado di purificazione: SDS-PAGE) | |
| Soluzione di acetato di sodio (3M) pH 5.2 | fornitore | ||
| Etanolo (assoluto) per biologia molecolare | Sigma-Aldrich | E7023 | o |
| equivalente Kit di clonaggio Topo TA (con vettore pCR2.1-TOPO) | Invitrogen | K4500-01 | |
| Kit di estrazione del gel QIAquick | QIAGEN | 28704 | |
| Agarosio | Sigma-Aldrich | A9539 | o |
| equivalente Bromuro di etidio. | Sigma-Aldrich | E1510 | o equivalente |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | o equivalente |
| 6x tampone di carico | ThermoScientific | R0611 | o equivalente |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 o FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Supporto magnetico dinale per provette da 2 ml | Invitrogen | 12321D | o |
| equivalente Kit Agencourt AMPure XP da 60 ml | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | fornitore | ||
| Agilent 2200 Sistema TapeStation | Agilent Technologies | G2964AA | o equivalente |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | o |
| reagenti D1000 | Agilent Technologies | 5067-5583 | o equivalente |
| Kit di quantificazione della libreria KAPA per piattaforme Illumina (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Sistema di PCR in tempo reale veloce | Biosystems applicato 4329003 | ||
| NaOH 1.0 N, molecolare | di laboratorio generale | ||
| HT1 (tampone di ibridazione) | Illumina | di reagenti MiSeq | |
| Kit di reagenti MiSeq v3 (150 cicli) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Sistema MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
Riferimenti
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet.
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Ristampe e permessi
