Retroviral skanning: Mapping MLV Integrering Sites for å definere Cell-spesifikke Regulatory Regioner
Summary
Her beskriver vi en protokoll for genomgående bred kartlegging av integrasjonssteder for Moloney murine leukemi virusbaserte retrovirale vektorer i humane celler.
Abstract
Moloney-murine leukemi (MLV) virusbaserte retrovirale vektorer integreres overveiende i acetylerte forsterkere og promotorer. Av denne grunn kan mLV integrasjonssteder brukes som funksjonelle markører av aktive regulatoriske elementer. Her presenterer vi et retroviralt skanningsverktøy, som muliggjør genomsøkende identifikasjon av celle-spesifikke forsterkere og promotorer. Kort fortalt blir målcellepopulasjonen transdusert med en mLV-avledet vektor, og genomisk DNA blir spaltet med et ofte kuttende restriksjonsenzym. Etter ligering av genomiske fragmenter med en kompatibel DNA-linker tillater linker-mediert polymerasekjedereaksjon (LM-PCR) amplifikasjonen av virus-vert-genom-krysset. Massiv sekvensering av amplikonene brukes til å definere mLV-integrasjonsprofilen genom-bred. Endelig defineres klynger av tilbakevendende integrasjoner for å identifisere celle-spesifikke regulatoriske regioner, som er ansvarlige for aktiveringen av spesifikke transkripsjonsprogrammer av celletype.
<p class= "Jove_content"> Det retrovirale skanningsverktøyet tillater genomspennende identifisering av celle-spesifikke promotorer og forsterkere i prospektive isolerte målcellepopulasjoner. Spesielt representerer retroviral skanning en instrumentteknikk for retrospektiv identifisering av sjeldne populasjoner ( f.eks . Somatiske stamceller) som mangler robuste markører for fremtidig isolasjon.Introduction
Cellidentitet bestemmes av uttrykket av spesifikke sett av gener. Rollen av cis-regulatoriske elementer, som for eksempel promotorer og forsterkere, er avgjørende for aktiveringen av spesifikke transkripsjonelle programmer av celletypen. Disse regulatoriske områdene kjennetegnes av spesifikke kromatinfunksjoner, som for eksempel spesielle histon-modifikasjoner, transkripsjonsfaktorer og ko-faktorbindinger, og kromatintilgjengelighet, som har vært mye brukt for deres genom-breddeidentifikasjon i flere celletyper 1 , 2 , 3 . Spesielt benyttes den genomgående profilen for acetylering av histon H3-lysin 27 (H3K27ac) vanligvis for å definere aktive promotorer, forsterkere og superforsterkere 4 , 5 , 6 .
Moloney murine leukemi virus (MLV) er et gamma retrovirus som er mye brukt for genOverføring i pattedyrceller. Etter infeksjon av en målcelle blir det retrovirale RNA-genomet retro transkribert i et dobbeltstrenget DNA-molekyl som binder virale og cellulære proteiner for å samle preintegrasjonskomplekset (PIC). PIC går inn i kjernen og binder vertscellekromatinet. Her medierer viral integrasen, en nøkkel PIC-komponent, integrering av det provirale DNA i vertscellegenomet. MlV-integrasjon i det genomiske DNA er ikke tilfeldig, men forekommer i aktive cis-regulatoriske elementer, slik som promotorer og forsterkere, på en celle-spesifikk måte 7 , 8 , 9 , 10 . Denne spesielle integrasjonsprofilen formidles av en direkte interaksjon mellom mLV integrasen og de cellulære bromodomain og extraterminalt domene (BET) proteiner 11 , 12 , 13 . BET-proteiner (BRD2, BRD3 ogBRD4) virker som en bro mellom vertschromatin og mLV PIC: Gjennom bromodomene anerkjenner de høyt acetylerte cis-regulatoriske regioner, mens extraterminalt domene interagerer med mLV integrase 11 , 12 , 13 .
Her beskriver vi retroviral skanning, et nytt verktøy for å kartlegge aktive cis-regulatoriske regioner basert på integrasjonsegenskapene til mLV. Kort fortalt blir celler transdusert med mLV-avledet retroviral vektor som uttrykker det forsterkede grønne fluorescerende protein (eGFP) reportergenet. Etter genomisk DNA-ekstraksjon forsterkes kryssene mellom den 3 'lange terminalrepetisjonen (LTR) av mlV-vektoren og det genomiske DNA ved hjelp av linker-mediert PCR (LM-PCR) og massivt sekvensert. MLV-integrasjonssteder er kartlagt til det humane genom og genomiske regioner som er svært målrettet av mLV, defineres som klynger av mLV-integrasjonssteder.
Retroviral skanningNing ble brukt til å definere celle-spesifikke aktive regulatoriske elementer i flere humane primære celler 14 , 15 . MLV-klynger samkartet med epigenetisk definerte promotorer og forsterkere, hvorav de fleste inneholdt aktive histon-merker, slik som H3K27ac, og var celle-spesifikke. Retroviral skanning tillater genomsøkende identifisering av DNA-regulatoriske elementer i prospektive rensede cellepopulasjoner 7 , 14 , så vel som i tilbakevendende definerte cellepopulasjoner, slik som keratinocytstamceller, som mangler effektive markører for fremtidig isolasjon 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en protokoll for genomsøkende kartlegging av integrasjonsstedene for mLV, et retrovirus som målretter kromatinregioner, epigenetisk merket som aktive promotorer og forsterkere. Kritiske trinn og / eller begrensninger av protokollen inkluderer: (i) mLV-transduksjon av målcellepopulasjonen; (Ii) amplifisering av virus-vert-kryssinger av LM-PCR; (Iii) gjenfinning av en høy andel av integrasjonssteder. MLV-baserte retrovirale vektorer overfører effektivt delende celler. Den lave effektiviteten ved transd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Det europeiske forskningsrådet (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), Det italienske ministeriet for utdanning, universiteter og forskning (FIRB-Futuro i Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro i Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), Det italienske Helsedepartementet (Unge forskere Ring 2011 GR-2011-02352026) og Imagine Institute Foundation (Paris, Frankrike).
Materials
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
Riferimenti
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
