Retroviral Scanning: Kartläggning av MLV-integrationswebbplatser för att definiera cellspecifika reglerande regioner
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för genomgående kartläggning av integrationsställena för Moloney-murina leukemivirusbaserade retrovirala vektorer i humana celler.
Abstract
Moloney-murina leukemi (MLV) -virusbaserade retrovirala vektorer integreras huvudsakligen i acetylerade förstärkare och promotorer. Av denna anledning kan mLV-integrationsställen användas som funktionella markörer av aktiva regleringselement. Här presenterar vi ett retroviralt avsökningsverktyg, vilket möjliggör genomspännande identifiering av cellspecifika förstärkare och promotorer. Kortfattat transduceras målcellpopulationen med en mlV-härledd vektor och genomiskt DNA digereras med ett ofta skärande restriktionsenzym. Efter ligering av genomfragment med en kompatibel DNA-länkare möjliggör länkmedierad polymeraskedjereaktion (LM-PCR) amplifieringen av virus-värdgenomförbindelserna. Massiv sekventering av amplikonerna används för att definiera mLV-integrationsprofilgenomfattande. Slutligen definieras kluster av återkommande integreringar för att identifiera cellspecifika reglerande regioner, som är ansvariga för aktiveringen av specifika transkriptionsprogram av celltyp.
<p class= "Jove_content"> Det retrovirala avsökningsverktyget möjliggör genomspännande identifiering av celspecifika promotorer och förstärkare i prospektivt isolerade målcellspopulationer. I synnerhet representerar retroviral avsökning en instrumental teknik för retrospektiv identifiering av sällsynta populationer ( t.ex. somatiska stamceller) som saknar robusta markörer för framtida isolering.Introduction
Cellidentitet bestäms av uttrycket av specifika uppsättningar av gener. Rollen av cis-regulatoriska element, såsom promotorer och förstärkare, är avgörande för aktiveringen av specifika transkriptionsprogram av celltyp. Dessa reglerande regioner karakteriseras av specifika kromatinegenskaper, såsom speciella histon-modifikationer, transkriptionsfaktorer och bindning av ko-faktorer, och kromatintillgänglighet, som har använts i stor utsträckning för deras genomomsättning i flera celltyper 1 , 2 , 3 . I synnerhet används den genom-breda profilen för acetylering av histon H3-lysin 27 (H3K27ac) vanligen för att definiera aktiva promotorer, förstärkare och superhöjande medel 4 , 5 , 6 .
Moloney-murin leukemivirus (MLV) är ett gamma-retrovirus som används allmänt för genenÖverföring i däggdjursceller. Efter infektion av en målcell retro-transkriberas det retrovirala RNA-genomet i en dubbelsträngad DNA-molekyl som binder virala och cellulära proteiner för att montera preintegrationskomplexet (PIC). PIC kommer in i kärnan och binder värdcell-kromatinet. Här medierar viral integrasen, en nyckel PIC-komponent, integreringen av det provirala DNA-värdet i värdcellgenomet. MlV-integration i det genomiska DNAet är inte slumpmässigt men förekommer i aktiva cis-regulatoriska element, såsom promotorer och förstärkare, på cellspecifikt sätt 7 , 8 , 9 , 10 . Denna speciella integrationsprofil förmedlas av en direkt växelverkan mellan mlV-integrasen och de cellulära bromodomain- och extraterminala domänen (BET) -proteinerna 11 , 12 , 13 . BET-proteiner (BRD2, BRD3 ochBRD4) fungerar som en bro mellan värdkromatin och mLV PIC: genom sina bromodominer känner de högt acetylerade cis-regulatoriska regioner, medan extraterminal domänen interagerar med mLV integras 11 , 12 , 13 .
Här beskriver vi retroviral scanning, ett nytt verktyg för att kartlägga aktiva cis-regulatoriska regioner baserat på integrationsegenskaperna för mLV. I korthet transduceras celler med mLV-härledd retroviral vektor som uttrycker den förstärkta grön fluorescerande proteinet (eGFP) reportergenen. Efter genomisk DNA-extraktion amplifieras korsningarna mellan 3'-lång terminalrepetitionen (LTR) hos mlV-vektorn och det genomiska DNAet med linkermedierad PCR (LM-PCR) och massivt sekventeras. MLV-integrationsställen är mappade till det humana genomet och genomiska regioner riktade med mLV definieras som kluster av mLV-integrationsställen.
Retroviral avsökningNing användes för att definiera cellspecifika aktiva regulatoriska element i flera humana primära celler 14 , 15 . MLV-klyftor kodade med epigenetiskt definierade promotorer och förstärkare, varav de flesta innehöll aktiva histonmärken, såsom H3K27ac, och var cellspecifika. Retroviral avsökning möjliggör genomspännande identifiering av DNA-reglerande element i prospektivt renade cellpopulationer 7 , 14 såväl som i retrospektivt definierade cellpopulationer, såsom keratinocytstamceller, som saknar effektiva markörer för prospektiv isolering 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrives ett protokoll för genombildning av integrationsställen för mLV, ett retrovirus som riktar sig mot kromatinregioner, epigenetiskt märkta som aktiva promotorer och förstärkare. Kritiska steg och / eller begränsningar av protokollet innefattar: (i) mLV-transduktion av målcellspopulationen; (Ii) amplifiering av virus-värdkryssningar med LM-PCR; (Iii) hämtning av en stor del av integrationsställen. MLV-baserade retrovirala vektorer transducerar effektivt delande celler. Den låga effektiviteten vid …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från Europeiska forskningsrådet (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), det italienska ministeriet för utbildning, universitet och forskning (FIRB-Futuro i Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro i Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics flaggskeppsprojekt), det italienska hälsovårdsministeriet (unga forskare kallar 2011 GR-2011-02352026) och Imagine Institute Foundation (Paris, Frankrike).
Materials
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
Riferimenti
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
