Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在<em>現場で</em>ハイブリダイゼーション
Summary
この論文では、ジゴキシゲニン（DIG）標識またはビオチン標識プローブを用いた昆虫アンテナにおいて、特に低レベル発現匂い受容体（OR）遺伝子ならびに他の遺伝子の詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコルについて記載している。
Abstract
昆虫は、外因性の化学信号を感知するための洗練された嗅覚受容系を進化させてきた。これらの化学シグナルは、アンテナのケモソーム（chemosensilla）と呼ばれる髪のような構造に収容された嗅覚受容器ニューロン（ORN）によって形質導入される。 ORNの膜上で、嗅覚受容器（OR）は匂いのコード化に関与していると考えられている。したがって、OR遺伝子に局在する遺伝子を同定できることは、OR遺伝子を認識するために必要であり、さらなる機能的in situ研究の基礎を提供する。昆虫のアンテナにおける特定のORのRNA発現レベルは非常に低く、組織学的に昆虫組織を保存することは困難である。したがって、RNA in situハイブリダイゼーションを使用して特定タイプの感覚器にORを局在化することは困難である。この論文では、特に昆虫の低発現OR遺伝子のための詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコールが導入されている。さらに、特定のOR 遺伝子WAOrcoをマーカーとして共発現する受容体遺伝子を用いた二重蛍光蛍光in situハイブリダイゼーション実験を行うことによって同定された。
Introduction
最も重要な化学感覚器官である昆虫のアンテナは、嗅覚受容器ニューロン（ORN）によって神経支配されている多くの髪のような構造（感覚器と呼ばれる）で覆われています。昆虫ORN類の膜上に、嗅覚受容体（ORS）、7つの膜貫通領域を含むタンパク質の種類は、臭気物質依存性イオンチャネル1、2、3として機能するヘテロマーを形成する共受容体（ORCO）で表されます。異なる論理和は、化学化合物4、5、6の異なる組み合わせに応答します。
Locusts（ Locusta migratoria ）は、主に嗅覚の手掛かりに基づいて重要な行動を誘発します7 。 Locust ORは、分子嗅メカニズムを理解するための重要な要素です。特定のイナゴまたは遺伝子をaのニューロンに局在化させるRNAによる形態特異的な感覚型RNA in situハイブリダイゼーション（RNA ISH）は、ORs機能の探索の第一歩である。
RNA ISHは、標識された相補的RNAプローブを使用して、組織、細胞または全身の部位の特定のRNA配列をインサイチュで測定し、局在化させ、生理学的プロセスおよび疾患の病因への洞察を提供する。ジゴキシゲニン標識（DIG標識）およびビオチン標識RNAプローブは、RNAハイブリダイゼーションにおいて広く使用されている。ジゴキシゲニン-11-UTPまたはビオチン-16-UTPによるRNA標識は、SP6およびT7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写によって調製することができる。 DIGおよびビオチン標識RNAプローブは以下の利点を有する：非放射性;安全;安定した;高感度;非常に特異的。 PCRおよびインビトロ転写を使用して産生が容易である。 DIGおよびビオチン標識されたRNAプローブは、色原体および蛍光で検出することができます。 DIG標識されたRNAプローブは、抗ジゴキシゲニンアルカリ高感度化学発光基質ニトロブルーテトラゾリウムクロライド/ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル – ホスフェートトルイジン塩（NBT / BCIP）、または光学顕微鏡を使用して2つの視覚化できるホスファターゼ（AP）共存顕微鏡を用いて4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウムヘミ – 塩化亜鉛塩（ファストレッド）とカップリングした4-ヒドロキシ-3-ナフトエ酸-2'-フェニルアニリドリン酸塩（HNPP）ビオチン標識RNAプローブは、共焦点顕微鏡を使用してフルオレセイン – チラミドで視覚化することができる抗ビオチンストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP） – コンジュゲート抗体で検出することができる。したがって、二色蛍光in situハイブリダイゼーションを実施して、DIGおよびビオチン標識RNAプローブを用いて、1つのスライス中の2つの標的遺伝子を検出することができる。
DIGおよび/またはビオチン標識プローブを用いたRNA ISHは、嗅覚関連遺伝子、例えばOR 、イオノトロピック受容体、匂い物質結合タンパク質感覚ニューロン膜タンパク質、 キイロショウジョウバエ 、 ハマダラカ 、L.のmigratoriaと砂漠バッタSchistoceraグレガリア 8、9、10、11、12、13、14、15、16、これらに限定され昆虫のアンテナではなく、です。 （1）OR遺伝子（ ORcoを除く）が低レベルで、少数の細胞でのみ発現され、シグナル検出を非常に困難にし、（2）昆虫組織を保存するためのRNA ISHを行う際に、2つの大きな課題がある。形態学が保存され、背景雑音が低いような組織学は、困難であり得る。この論文では、昆虫におけるOR遺伝子の局在化のためのRNA ISHを説明する詳細で効果的なプロトコル発色およびTyramide Signal Amplification（TSA）検出の両方を含むアンテナが提示されます。
Protocol
注：RNA分解を制限するために、湿式オートクレーブ蒸留水（121℃で60分間）および湿式オートクレーブ材料を使用して溶液を調製します。 RNA ISHアンチセンスプローブおよびセンスプローブの調製 標的遺伝子増幅および精製 断片の両端にアデニンを付加Taq DNAポリメラーゼとLmigOR1の完全長cDNAを含むプラスミドから：まず、L. migra…
Representative Results
色素産生の検出では、すべての成人の触角部分における触角細胞の小さなサブセットを、DIG標識LmigOR1およびLmigOR2アンチセンスプローブで示した（ 図3 ）。 LmigOR1とLmigOR2を局在化するために連続切片上のRNA ISHは、二つの遺伝子を発現する触角細胞が推定LmigOR1とLmigOR2が実際ORN類（ 図4aの</str…
Discussion
ORCO以外のOR遺伝子の発現レベルが非常に低く、昆虫アンテナの組織学的スライスを保存することが非常に困難であるため、昆虫のアンテナでOR遺伝子を局在化するRNA ISHを行うことは困難である。さらに、TSAの検出も非常に難しいです。これらの問題に対処するには、以下の措置を講じる必要があります。アンテナは、スライド上に形態を維持する薄く柔らかい触角鞘を有する新しく成…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団（No.31472037）からの助成金によって支えられている。この記事の商号または商用製品についての言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、推薦を意味するものではありません。
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Xu, X., You, Y., Zhang, L. Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (125), e55924, doi:10.3791/55924 (2017).