Ensaio para fosforilação e vinculação de Microtubule juntamente com a localização da proteína Tau em células de cancro colo-rectal
Summary
Este manuscrito descreve protocolos padrão para medir a tau hyperphosphorylation, medindo a vinculação de tau de microtúbulos e localização de tau intracelular após tratamentos com drogas. Estes protocolos podem ser usados repetidamente para triagem de drogas ou outros compostos que se destinam a ligação de hyperphosphorylation ou microtubule tau.
Abstract
O tau de proteína microtubule-associada é uma proteína neuronal que localiza-se principalmente em axônios. Geralmente o tau é essencial para o normal funcionamento neuronal porque está envolvido na estabilização e montagem de microtúbulos. Além de neurônios, tau é expresso em humana mama, próstata, gástrica, colorretal e cânceres pancreáticos, onde mostra a estrutura quase semelhante e exerce funções semelhantes como o tau neuronal. A quantidade de tau e sua fosforilação pode alterar o seu funcionamento como um estabilizador de microtúbulos e levar ao desenvolvimento de filamentos helicoidais emparelhados em doenças neurodegenerativas diferentes, tais como a doença de Alzheimer. Determinar o estado de fosforilação da tau e suas características de microtubule-ligação é importante. Além disso, examinar a localização intracelular do tau é importante em diferentes doenças. Este manuscrito detalhes protocolos padrão para medir a fosforilação da tau e tau vinculação de microtúbulos nas células de cancro colo-rectal com ou sem a curcumina e tratamento LiCl. Esses tratamentos podem ser usados para parar o desenvolvimento e proliferação de células cancerosas. Localização intracelular do tau é examinada com o uso de imuno-histoquímica e microscopia confocal enquanto estiver usando quantidades baixas de anticorpos. Estes ensaios podem ser usados repetidamente para compostos que afetam hyperphosphorylation tau ou vinculação do microtubule de triagem. Novela terapêutica usada para diferentes Tauopatias ou agentes anticancerígenos relacionados potencialmente podem ser caracterizados usando esses protocolos.
Introduction
Tau foi originalmente identificada como uma proteína associada a microtúbulos estável ao calor que estava co purificada com tubulina1. Tau é exclusivamente expressos em eucariontes superiores2,3,4. A principal função do tau é controlar microtubule montagem1,5,6. Também contribui para a polimerização de microtúbulos7, transporte axonal8, alterações no diâmetro axonal9, formação de neuroma polaridade e neurodegeneração10. Tau também atua como um andaime de proteína para controlar algumas vias de sinalização. Estudos do cérebro de rato sugerem que tau é neurônio-específica e que é principalmente localiza em axônios11. Porque tau é essencial para o desenvolvimento neuronal e polimerização de microtúbulos, tau era a hipótese de desempenhar um papel importante no desenvolvimento axonal no sistema nervoso central; mais tarde, esta hipótese foi verificada por experimentos in vitro e in vivo . Além dos neurônios, tau é expressa em células não-neuronais diferentes, incluindo fígado, rim e músculo células12,13. Tau é expressa também em humana mama, próstata, colorretal, gástrica e câncer pancreático célula linhas e tecidos14,15,16,17,18, 19. tau é também encontrado na miosite inclusão-corpo como torcida tubulofilaments em corpos de inclusão20.
Tau pode transportar várias modificações borne-translational. De todas as modificações borne-translational, fosforilação é a mais comum. Fosforilação da tau aumento diminui sua afinidade para os microtúbulos, finalmente, desestabilizando o citoesqueleto. Oitenta e cinco sítios de fosforilação têm sido descritos na proteína tau isolada de tecidos do cérebro humano a doença de Alzheimer. Desses sites, 53% constituem apenas 6% tirosina resíduos21,22,23, 41% de treonina e serina. Fosforilação da Tau afeta sua localização, função, ligação, solubilidade e sua susceptibilidade a outras modificações borne-translational. Também fosforilação de tau a mais do que na medida do normal (ou totalmente saturada com grupos fosfato) é conhecido como hyperphosphorylation que Replica as características estruturais e funcionais da doença de Alzheimer24. Tau mantém o bom funcionamento dos microtúbulos axonal e assegura o funcionamento neuronal normal sob condições fisiológicas. No entanto, hyperphosphorylated tau não consegue manter uma vinculação microtubule bem-organizado, causando perda neuronal por causa de desmontagem do microtubule. Níveis normais de fosforilação da tau são necessários para tau adequado funcionamento, mas tau não funcionar normalmente, se seu nível de fosforilação característico é alterada e se hyperphosphorylated25. Na doença de Alzheimer e algumas outras doenças neurodegenerativas relacionadas com a idade, tau torna-se hyperphosphorylated e forma filamentos helicoidais emparelhados e tangles neurofibrillary26,27. Assim, os métodos para determinar a fosforilação da tau e vinculação de microtúbulos são importantes.
Câncer colorretal, câncer um envelhecimento associada, é que o terceiro mais frequentemente diagnosticado cancro e o terceiro câncer proeminente causadores de morte para homens e mulheres28. Cancro colo-rectal é um dos principais cânceres causadoras de morte no mundo ocidental29. Porque tanto câncer colorretal e doença de Alzheimer estão associados com o envelhecimento e ambos acontecem principalmente em países desenvolvidos, onde as pessoas gostam de hábitos alimentares semelhantes, as duas doenças de alguma forma podem ser correlacionadas. Além disso, as células cancerosas positiva tau e tau respondem de forma diferente de agentes quimioterápicos, por exemplo, paclitaxel16.
A curcumina é um dos principais derivativos de Curcuma longa, açafrão especiaria indiana30. Durante séculos, as populações do Sul da Ásia consumiu cúrcuma em suas dietas em uma base diária. A curcumina é usada para tratar diferentes doenças, incluindo câncer colorretal, doença de Alzheimer, diabetes, fibrose cística, doença inflamatória intestinal, artrite, hiperlipidemia, aterosclerose e cardiopatia isquêmica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lítio também pode matar células de câncer colorretal ou impedir a sua proliferação39. Lítio também pode ser usado para tratar a doença de Alzheimer40 que diminui a agregação de tau e impede a sua hyperphosphorylation, como observado em um rato transgênico modelo41,42,43, 44.
Este manuscrito visa: 1) medir o tau total e os níveis de expressão de fosfo-tau em células tratadas; 2) descrevem um ensaio da fosfatase para medir global fosforilação da tau; 3) examinar microtubule-vinculação de tau; e 4) localizar tau pela microscopia confocal em linhas de células de câncer colorretal tratados com curcumina ou LiCl. Os resultados revelam que tratamento com células com curcumina, um supostamente bom agente quimioterapêutico para câncer de cólon, e tratamento com LiCl pode reduzir a expressão de ambos total tau fosforilada tau em linhas de células de câncer colorretal. Estes tratamentos também podem causar a translocação nuclear de tau. No entanto, inesperadamente, a curcumina falha melhorar a ligação do tau de microtúbulos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito estabeleceu diferentes condições processuais para a detecção de tau total e fosforilada tau em células de cancro colo-rectal, tratados com curcumina e LiCl. Para avaliar o status geral de fosforilação da tau em amostras da proteína, foi descrito um ensaio da fosfatase. Este ensaio potencialmente pode ser usado para examinar o status de fosforilação de proteínas.
Este ensaio é baseado no princípio de que fosforilado proteína movimentos mais lento do que o seu estad…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi realizada como parte do projeto intitulado ‘Desenvolvimento e industrialização de matérias primas cosméticas de alto valor de microalgas marinhas’, financiado pelo Ministério dos oceanos e das pescas, Coreia e foi apoiado por uma subvenção intramural (2Z04930) KIST Gangneung Instituto de produtos naturais.
Materials
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X – 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
Riferimenti
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