Analys för fosforylering och mikrotubuli bindande tillsammans med lokalisering av Tau-Protein i kolorektal cancerceller

Summary

Detta manuskript beskriver standardprotokoll för mätning av tau hyperphosphorylation, mäta tau bindning till mikrotubuli och lokalisering av intracellulära tau efter läkemedelsbehandlingar. Dessa protokoll kan användas upprepade för screening droger eller andra föreningar som riktar tau hyperphosphorylation eller mikrotubulära bindande.

Abstract

Det mikrotubulära-associerade proteinet tau är ett neuronala protein som lokaliserar mestadels i axoner. Allmänhet är tau viktigt för normal neuronal funktion eftersom det är engagerade i mikrotubuli montering och stabilisering. Förutom nervceller uttrycks tau i mänskliga bröstcancer, prostatacancer, gastric, kolorektal, och pankreas cancer där det visar nästan liknande struktur och utövar liknande funktioner som den neuronala tau. Mängden av tau och dess fosforylering kan ändra dess funktion som en stabilisator av mikrotubuli, och leda till utveckling av Parade spiralformade filament i olika neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom. Det är viktigt att fastställa tillståndet fosforylering av tau och dess mikrotubulära-bindande egenskaper. Dessutom är undersöker den intracellulära lokaliseringen av tau viktigt i olika sjukdomar. Detta manuskript Detaljer standard protokoll för mätning av tau fosforylering och tau bindning till mikrotubuli i kolorektal cancerceller med eller utan curcumin och LiCl behandling. Dessa behandlingar kan användas för att stoppa cancer cell spridning och utveckling. Intracellulära lokalisering av tau undersöks med hjälp av immunohistokemi och konfokalmikroskopi medan du använder låga mängder antikroppar. Dessa analyser kan användas upprepade för screening föreningar som påverkar tau hyperphosphorylation eller mikrotubulära bindande. Romanen therapeutics används för olika tauopathies eller relaterade cytostatika kan potentiellt karakteriseras med hjälp av dessa protokoll.

Introduction

Tau identifierades ursprungligen som ett heat-stable mikrotubulära-associerade protein som var samtidig renat med tubulin¹. Tau uttrycks enbart i högre eukaryotes^2,3,4. Tau huvudsakliga funktion är att styra mikrotubulära montering^1,5,6. Det bidrar också till polymerisation av mikrotubuli⁷, axonal transport⁸, förändringar i axonal diameter⁹, bildandet av neurom polaritet och neurodegeneration¹⁰. Tau fungerar också som en protein byggnadsställning att styra vissa signalvägar. Rat hjärnan studier tyder på att tau är neuron-specifika och att det primärt lokaliserar i axoner¹¹. Eftersom tau är viktigt för mikrotubuli polymerisation och neuronal utveckling, antogs tau för att spela en viktig roll i axonal utveckling i det centrala nervsystemet; Denna hypotes var senare verifierade av in vitro- och in-vivo experiment. Förutom nervceller uttrycks tau i olika icke-neuronala celler, inklusive lever, njure och muskel celler^12,13. Tau uttrycks också i mänskliga bröstcancer, prostatacancer, kolorektal-, ventrikel, och bukspottskörteln cancer cell linjer och vävnader^{14,15,16,17,18, 19}. tau finns även i inkludering-body myosit som vridna tubulofilaments i organ i inkludering²⁰.

Tau kan bära flera post-translationella modifieringar. Alla post-translationella modifieringar är fosforylering den vanligaste. Ökad tau fosforylering minskar dess affinitet för mikrotubuli, slutligen destabiliserande cytoskelettet. Åttiofem fosforylering platser har beskrivits i tau-protein som isolerats från mänskliga Alzheimers sjukdom hjärnans vävnader. Av dessa webbplatser utgör 53% serine, 41% treonin och bara 6% tyrosin rester^21,22,23. Tau fosforylering påverkar dess lokalisering, funktion, bindande, löslighet och dess känslighet för andra post-translationella modifieringar. Även tau fosforylering till mer än den normal omfattningen (eller helt mättade med fosfatgrupper) kallas hyperphosphorylation som replikerar strukturella och funktionella egenskaper hos Alzheimers sjukdom²⁴. Tau upprätthåller fungerande de axonal mikrotubuli och garanterar normal neuronal funktion under fysiologiska betingelser. Men misslyckas hyperphosphorylated tau att upprätthålla en välorganiserad mikrotubulära bindning, orsakar neuronala förlust på grund av mikrotubuli isärtagning. Normala nivåer av tau fosforylering krävs för korrekt tau funktion, men tau misslyckas att fungera normalt om dess karakteristiska fosforylering nivå ändras och om det är hyperphosphorylated²⁵. I Alzheimers sjukdom och vissa andra åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar, tau blir hyperphosphorylated och bildar Parade spiralformade filament och fibrillnystan^26,27. Metoder för att bestämma tau fosforylering och mikrotubuli bindning är alltså viktigt.

Kolorektal cancer, en åldrande-associerade, är tredje vanligaste diagnosen cancer och tredje framträdande död-orsakar cancer för både män och kvinnor²⁸. Kolorektal cancer är en av de viktigaste död som orsakar cancer i västvärlden²⁹. Eftersom både kolorektal cancer och Alzheimers sjukdom är associerad med åldrande och båda sker främst i de utvecklade länderna där människor njuta av liknande matvanor, kan de två sjukdomarna på något sätt vara korrelerade. Dessutom reagerar tau-positiv och tau-negativ cancerceller olika på kemoterapeutika, t.ex., paklitaxel¹⁶.

Curcumin är en av de främsta derivat av Curcuma longa, Indisk krydda gurkmeja³⁰. I århundraden har södra asiatiska populationer konsumeras gurkmeja i sin kost på en daglig basis. Curcumin är används för att behandla olika sjukdomar, inklusive kolorektal cancer, Alzheimers sjukdom, diabetes, cystisk fibros, inflammatorisk tarmsjukdom, artrit, hyperlipidemi, åderförkalkning och ischemisk hjärtsjukdom^{31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38}. litium kan också döda kolorektal cancerceller eller förhindra deras spridning³⁹. Litium kan också användas för att behandla Alzheimers sjukdom⁴⁰ som den minskar tau aggregering och motverkar dess hyperphosphorylation som observerats i en transgen mus modell^{41,42,43, 44}.

Detta manuskript syftar till att: 1) mäter totalt tau och phospho-tau uttrycksnivåerna i behandlade celler; (2) Beskriv ett fosfatas-test för att mäta övergripande tau fosforylering; (3) undersöka mikrotubulära-bindningen av tau; och 4) lokalisera tau av konfokalmikroskopi i kolorektal cancer cellinjer behandlas med curcumin eller LiCl. Resultaten visar att cellen behandling med curcumin, som är en förment bra kemoterapeutiska medel för tjocktarmscancer, och behandling med LiCl kan minska uttryck för båda totalt tau och fosforyleras tau i kolorektal cancer cellinjer. Dessa behandlingar kan också orsaka translokationen i cellkärnan Tau. Men oväntat, misslyckas curcumin att förbättra bindningen av tau till mikrotubuli.

Protocol

1. beredning av reagens Lägg till 10 µL av (1 mM) phenylmethylsulfonyl fluor lösning, 10 µL (1 x 100 x lagervara) proteas hämmare cocktail lösning och 10 µL (1 x 100 x lagervara) fosfatas hämmare cocktail lösning 1 ml 1 x radioimmunoprecipitation (RIPA) analysbuffert att förbereda den komplett RIPA lyseringsbuffert. Förbered 10 x allmänna tubulin buffert (PEM) buffert. Lägg till 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N ' – bis – 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95,1 mg)…

Representative Results

Uttryck för totalt tau och phospho-tau undersöktes efter behandling av cellerna med olika koncentrationer av curcumin eller LiCl (figur 1). Behandling av celler med de tre olika koncentrationerna av curcumin minskade nivåer av tau uttryck; phospho-tau expression ökade vid behandling med låg koncentration av curcumin men minskade vid behandling av celler med högre curcumin koncentration. Anti-phospho-tau (Ser396) användes för detektion av phospho-tau. …

Discussion

Detta manuskript etablerade olika processuella förutsättningarna för att upptäcka totalt tau och fosforyleras tau i kolorektal cancerceller behandlas med curcumin och LiCl. För att bedöma övergripande phosphorylation status för tau i protein prover, beskrevs ett fosfatas assay. Denna analys kan användas för att undersöka phosphorylation status för något protein.

Denna analys bygger på principen att fosforyleras protein rörelser långsammare än dess icke-fosforyleras tillstånd….

Materials

HCT 116 cell	ATCC	CCL-247
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Store at -20 °C
penicillin-streptomycin	Hyclone	SV30010
Trypsin-EDTA solution	WelGene	LS 015-01
100 mm dish	Corning	430161
6 well plate	Corning	Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody	abcam	ab19030
Dithiothreitol (DTT)	Roche	10 708 984 001	Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T1912	Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT)	Cytoskeleton	MT001	Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide	Sigma	72068
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M2670
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Store at -20 °C
DPBS	WelGene	LB 001-02
Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	Model 500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
PIPES	Sigma	P1851
Bovine serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906
Molecular Imager	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Store at 4 °C
Protein assay dye reagent	Bio-Rad	500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb	Cell signalling	2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signalling	2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody	abcam	ab109390
EGTA	Sigma	E3889	Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase	Thermo Scientific	EF0651	Store at -20 °C
PMSF	Sigma	P7626	Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Cell Signalling	5870	Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail	Cell Signalling	5871	Store at 4 °C
RIPA Buffer	Sigma	R 0278	Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human	Sigma	T 9950	Store at -20 °C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X – 100	Store at around 25 °C
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11005	Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy	Leica Microsystem	Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Affymetrix	75819
Protein Assay	Bio-Rad	500-0006	Store at 4 °C