EN<em> Caenorhabditis elegans</em> Næringsstatusbasert kobber-aversjonsanalyse

Summary

Her presenterer vi en Caenorhabditis elegans- spesifikke analyse designet for å evaluere endringer i kobberavviksadferd og muligheten til å lokalisere en felles matkilde, ettersom organismen utvikler seg fra en velfødt til sulten ernæringsmessig tilstand.

Abstract

For å sikre overlevelse må organismer være i stand til å unngå ugunstige habitater samtidig som det sikres en konsekvent matkilde. Caenorhabditis elegans endrer deres lokomotivsmønstre ved påvisning av ulike miljøstimuli og kan modulere deres pakke med atferdsrespons som svar på sultforhold. Nematoder utviser vanligvis en redusert aversiv respons når de fjernes fra en matkilde i over 30 minutter. Observasjon av atferdsendringer som svar på en forandret ernæringsstatus kan gi innsikt i mekanismene som regulerer overgangen fra en velmattet til sultet tilstand.

Vi har utviklet en analyse som måler en nematode evne til å krysse en aversive barriere ( dvs. kobber) og nå en matkilde over en lengre periode. Denne protokollen bygger på tidligere arbeid ved å integrere flere variabler på en måte som muliggjør fortsatt datainnsamling når organismer skifter mot aN stadig sultet tilstand. Videre tillater denne analysen en økt prøvestørrelse slik at større populasjoner av nematoder kan evalueres samtidig.

Organer som er defekte for evnen til å oppdage eller reagere på kobber, krysser straks kjemisk barriere, mens wild type nematoder i utgangspunktet avstøtes. Som vill type ormer blir stadig sultet, begynner de å krysse barrieren og nå matkilden. Vi utformet denne analysen for å evaluere en mutant som ikke er i stand til å reagere på ulike miljømessige tegn, inkludert matopplevelse eller påvisning av aversive kjemikalier. Når de ble evaluert via denne protokollen, krysset de defekte organismene straks barrieren, men var heller ikke i stand til å oppdage en matkilde. Derfor krysser disse mutantene gjentatte ganger kjemisk barriere til tross for at de nå en matkilde. Denne analysen kan rett og slett teste populasjoner av ormer for å evaluere potensielle banefeil relatert til aversjon og sult.

Introduction

Caenorhabditis elegans har blitt brukt som en modell for studiet av nevrobiologi i flere tiår på grunn av den relative lettheten ved å analysere kretsen av et nervesystem som består av bare 302 nevroner ¹ . Forutsatt at organismen er avhengig av å reagere på miljømessige tegn, er mye av nervesystemet dedikert til å regulere integrasjonen av miljøsignaler ² . Til tross for enkelheten i nervesystemet, kan C. elegans oppdage og reagere på ulike miljøsignaler, inkludert repellenter ³ , attractants ⁴ , temperatur ⁵ og til og med fuktighet ⁶ . En unnlatelse av å integrere miljøsignaler har blitt knyttet til en rekke av adferdsforstyrrelser og nevrodegenerative tilstander i pattedyrmodellsystemer ^{7- 9.} Med en rekke tilgjengelige neurale sykdomsmodeller ¹⁰ i C. elegans og utviklingen av nematode farmasøytiske skjermer ¹¹ , har denne organismen vist seg å være et nyttig system for studiet av neurobiologi. Gitt tilgjengeligheten av en kartlagt nematode-forbindelse ¹ og mutasjoner til nesten hvert gen i nematodegenomet ¹² , er vår forståelse for nematode-nervesystemet, og i forlengelse vår egen, delvis begrenset av utformingen av kreativt hensiktsmessige analyser.

En rekke kjemotaksanalyser har blitt utviklet de siste 40 årene for å evaluere nematoderesponsivitet til forskjellige aversive stimuli ^{3 , 4 , 13 , 14 , 15} . Førstegangsforsøk involverte innføringen av en akutt miljøstimulus mens en enkelt orm gikk på en agarplate= "Xref"> 3 ^{, 14 , 16} . Umiddelbare endringer i lokomotivsvar ble registrert. For eksempel kan den flyktige luktende oktanol påføres et hår og vevet foran en nematods nese for å stimulere initieringen av bakover-bevegelse i vildtype ormer ¹⁷ . Flere komplekse analyser er også utviklet for å inkorporere flere variabler som et middel til å vurdere atferdsvalg ¹⁸ . En variant av denne analysen innebærer bruk av en kobberløsning for å skape en aversiv midterbarriere ⁴ . Et attraktivt middel, nemlig diacetyl, ble plassert på den ene siden av den kjemiske barrieren med ormer overført fra diacetylkilden. Ormer som er defekte for kobber aversive responser krysset straks barrieren for å nå diacetylen, mens villtype ormer ble opprinnelig avstøt av barrieren. Respons ble scoret da ormer først nærmet seg kobberbarrierenUten langsiktige observasjoner.

Når ormer vurderes etter å ha gjennomgått sultevilkår, blir deres følsomhet for miljøstimuli redusert ¹⁹ . Når den aversive kjemiske oktanolen er ventet foran nematodnosen, stimulerer villtype organismer bakoverbevegelse innen 3 – 5 s når de er på mat. Etter at disse organismene er fjernet fra mat i 10 minutter, utviser de en forsinket respons på 8 – 10 s ²⁰ . Således med økt sult, viser nematoder en redusert aversiv respons på skadelige miljøsignaler, ettersom søket etter mat blir mer avgjørende for overlevelse. Omvendt reagerer ikke nematoder som overtrykkende nevropeptidreseptor 9 ( npr-9) på oktanol på eller av mat og viser manglende evne til å reagere på en rekke aversive stimuli ²¹ . Disse npr-9 (GF) organismer modulerer heller ikke deres reverseringsfrekvens i nærvær av mat, men kanOmvendt som svar på sterke berøringsstimulasjoner som indikerer at de er i stand til bakover-bevegelse ²¹ . Vi har også vurdert npr-9 (LF) mutanter gitt at de utviser en unormalt redusert reverseringsfrekvens av mat, men kan modulere deres oppførsel i nærvær av mat ²¹ . Kobling av ormens næringsstatus med innføring av akutte ytre stimuli har hjulpet til å belyse mekanismene ved hvilke en matrelatert vei i stor grad kan modulere sensoriske signalveier ^{22 , 23} . Tilstedeværelsen av mat i nematode-miljøet har også blitt brukt til å evaluere etanol-tilbaketaksreaksjoner ²⁴ . I dette forsøket ble ormer inkubert i varierende konsentrasjoner av etanol og deretter plassert på en agarplate med en lapp av mat kjent som et "mat-race-assay". Maten lapp ble plassert på en kant av platen mens nematoder wEre plassert vekk fra matkilden. Etanoluttak ble evaluert ved å måle varigheten av tiden som er nødvendig for ormer for å nå maten.

Denne næringsbaserte kobberaversjonstesten bygger på mat-raseanalysen for å integrere ytterligere miljøvariabler, nemlig mat og kobber, mens man vurderer atferdsendringer over tid. Dette er en tilpasning av en vanlig bruk protokoll i hele C. elegans samfunnet ⁴ . Denne protokollen har blitt brukt til å evaluere aversive responser og påvisning av mat over en fire-timers periode ²¹ . Siden ormen utviser sultedrag etter 30 minutter med matmangel ²⁵ , kan vi også vurdere hvordan endringer i ernæringsstatus kan påvirke miljøresponsene. Forholdene i denne analysen måler hvordan eksperimentelle organismer forandrer responsiviteten til aversive stimuli over tid, og derfor vurderer det atferdsendringer somOrganismers fremgang mot en sultet tilstand (og fortsatte målinger av langvarig sult). Siden npr-9 (GF) dyrene ikke endrer sin oppførsel som svar på mat eller mange aversive signaler, søkte vi å identifisere om disse beteendeunderskuddene vil fortsette i sammenheng med sult. Til slutt er denne analysesignalet formulert for å spesifikt vurdere npr-9 (GF) mutanter, men kan videre tilpasses til å også karakterisere nye stammer.

Protocol

1. Fremstilling av eksperimentelle organismer Velg 10 L4 iscenesatte nematoder pr. Belastning 24 timer før analysen starter for å sikre at organismer er unge voksne når de testes. For hver mutant eller kontroll nematode testet, velg 10 L4s (10 for kontrollen og 10 for analysen). Opprettholde L4 organismer ved bruk av standardmetoder 26 , 27 i 24 timer på standard agarplater frøet med OP50 Escherichia coli . Hvis…

Representative Results

Vi benyttet villtype (N2), npr-9 (tm1652) og en npr-9 overekspresjonstamme, dvs. npr-9 (GF) (IC836 – npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), for å evaluere respons på sult og kobberaversjon. Vildtyporganismer er i stand til å detektere og reagere på den aversive kobberbarrieren, mens npr-9 (GF) -mutanter ikke initierer en aversiv respons på kobberet over 4 h-analysen 21 . Etter 30 minutter av sult kr…

Discussion

Denne analysesignal modifiserer matkjøringsanalysen ^{24 for} å inkludere en kobberløsning for å skape en aversiv midterbarriere og rundt kanten av platen for å forhindre tap av nematoder. Organer testes for deres evne til å krysse aversive barriere og nå en matrett i løpet av en 4 h periode. I sammenheng med npr-9 (GF) har vi benyttet denne analysen for å vurdere hvordan sultningsforholdene kan påvirke aversive responser og påvisning av mat. Forutsatt at vi tidligere hadde karak…

Materials

M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M