Fluorescenza-mediata di tomografia per la rilevazione e la quantificazione di infiammazione intestinale murina del macrofago-correlati
Summary
Specifica della destinazione sonde rappresenta uno strumento innovativo per l’analisi dei meccanismi molecolari, come espressione della proteina in vari tipi di malattia (ad es., infiammazione, infezione e tumorigenesi). In questo studio, descriviamo una valutazione tomografica tridimensionale quantitativa di infiltrazione del macrofago intestinale in un modello murino di colite usando la tomografia di fluorescenza-mediata specifica per F4/80.
Abstract
Modelli murini di malattia sono indispensabili alla ricerca scientifica. Tuttavia, molti strumenti diagnostici quali l’endoscopia o formazione immagine tomografica non sono abitualmente impiegati nei modelli animali. Letture sperimentali convenzionali spesso si basano su analisi post-mortem ed ex vivo , che impediscono gli esami di follow-up intra-individuali e aumentano il numero di animali di studio necessari. Fluorescenza-mediata tomografia consente la valutazione non invasiva, ripetitiva, quantitativa e tridimensionale di sonde fluorescenti. È altamente sensibile e consente l’utilizzo di produttori di molecolare, che permette la rilevazione specifica e caratterizzazione di bersagli molecolari distinte. In particolare, sonde mirate rappresentano uno strumento innovativo per l’analisi di espressione genica della proteina e l’attivazione in infiammazione, malattia autoimmune, infezione, malattia vascolare, migrazione cellulare, tumorigenesi, ecc. In questo articolo, forniamo istruzioni dettagliate su questa sofisticata tecnologia di imaging per la rilevazione in vivo e la caratterizzazione di infiammazione (cioè, l’infiltrazione del macrofago di F4/80-positivo) in un modello murino ampiamente usato di infiammazione intestinale. Questa tecnica potrebbe essere utilizzata anche in altre aree di ricerca, quali il rilevamento delle cellule o cellule staminali immune.
Introduction
Modelli animali sono ampiamente utilizzati nella ricerca scientifica, ed esistono molte procedure non invasive per monitorare l’attività della malattia e vitalità, come la quantificazione delle variazioni di peso corporeo o l’analisi del sangue, delle urine e le feci. Tuttavia, questi sono solo i parametri di surrogati indiretti che sono anche soggetti a variabilità inter-individuale. Essi frequentemente devono essere accompagnate da analisi post-mortem del campione di tessuto, che impedisce l’osservazione seriale in momenti ripetitivi e diretta osservazione del fisiologico o patologico elabora in vivo. Sofisticate tecniche di imaging di piccoli animali sono emersi, tra cui croce componibile imaging, imaging ottico e l’endoscopia, che consente la visualizzazione diretta di questi processi e consente anche analisi ripetitivi della stessa animali1 , 2 , 3. Inoltre, la possibilità di monitorare in modo ripetitivo vari Stati di malattia nello stesso animale potrebbe diminuire il numero di animali necessari, che potrebbe essere desiderabile da un punto di vista etico degli animali.
Diverse tecniche di imaging ottici differenti esistono per in vivo imaging di fluorescenza. Originariamente, imaging confocale è stata impiegata per studiare la superficie e di sottosuolo eventi fluorescente4,5. Recentemente, tuttavia, tomografiche sistemi che consentono per le valutazioni quantitative del tessuto tridimensionale sono stati sviluppati6. Questo è stato compiuto attraverso lo sviluppo di sonde fluorescenti che emettono luce nello spettro infrarosso vicino (NIR), che offre a basso assorbimento, rivelatori sensibili e sorgenti di luce monocromatica7. Mentre le tecniche di imaging cross-sectioning tradizionali, come la tomografia computata (CT), la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) o ecografia (US), si basano principalmente su parametri fisici e visualizzare la morfologia, imaging ottico può fornire ulteriori informazioni sui processi molecolari sottostanti utilizzando endogene o esogene fluorescenti sonde8.
Progressi della biologia molecolare hanno contribuito a facilitare la generazione di sonde molecolari fluorescenti e mirate per un crescente numero di bersagli. Ad esempio, ricevitore-ha mediato l’assorbimento e la distribuzione in una zona di destinazione specificata può essere visualizzati utilizzando carbocyanine derivato-etichettato anticorpi9. L’abbondanza di anticorpi disponibili, che possono essere etichettati come elementi traccianti specifici in zone altrimenti inaccessibili del corpo, fornisce approfondimenti senza precedenti di processi cellulari e molecolari in modelli di tumorigenesi e neurodegenerative, malattie cardiovascolari, immunologica e infiammatoria7.
In questo studio, descriviamo l’uso di tomografia fluorescenza-mediata in un modello murino di colite. Destrano solfato di sodio (DSS)-colite indotta è un modello standard del mouse chimicamente indotta di infiammazione intestinale simile infiammatorie intestinali (IBD) la malattia10. È particolarmente utile valutare il contributo del sistema immunitario innato allo sviluppo dell’intestino infiammazione11. Poiché il reclutamento, l’attivazione e infiltrazione di monociti e macrofagi rappresentano passaggi cruciali nella patogenesi delle IBD, visualizzazione della loro assunzione e la cinetica di infiltrazione sono essenziali per monitoraggio, ad esempio, l’effetto di sostanze terapeutiche potenziali in un’ impostazione preclinici12. Descriviamo l’induzione di colite DSS e dimostrare la caratterizzazione tomografia-mediata di infiltrazione dei macrofagi nella mucosa dell’intestino usando la fluorescenza molecolare tomografia per la visualizzazione di specifica del marcatore del monocito/macrofago F4/80 13. Inoltre, ci illustrano le procedure ausiliari e supplementari, come l’etichettatura dell’anticorpo; la messa a punto sperimentale; e analisi e interpretazione delle immagini ottenute, in correlazione con le letture convenzionali quali gli indici di attività di malattia, flusso cytometry e l’analisi istologica e immunoistochimica. Discutiamo le limitazioni di questa tecnica e i confronti con altre modalità di formazione immagine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se le tecniche di imaging medicale si sono evolute rapidamente negli ultimi anni, siamo ancora limitati nella nostra capacità di rilevare processi infiammatori o tumori, nonché altre malattie, nelle loro prime fasi di sviluppo. Tuttavia, questo è fondamentale per la crescita del tumore di comprensione, invasione, o lo sviluppo di metastasi e processi cellulari, nello sviluppo di patologie infiammatorie e malattie degenerative, cardiovascolari e immunologiche. Mentre le tecniche di imaging tradizionale si basano …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la sig. ra Sonja Dufentester, Sig. ra Elke Weber e la signora Klaudia Niepagenkämper per l’eccellente assistenza tecnica.
Materials
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
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