In Situ Karakterisering af Shewanella oneidensis MR1 biofilm af SALVI og ToF-SIMS

Summary

Denne artikel præsenterer en metode til dyrkning af en biofilm for i situ time of flight sekundære ion massespektrometri for kemiske kortlægning i sin hydreret tilstand er aktiveret af et mikrofluid reaktor, System til analyse på grænsefladen flydende vakuum. Shewanella oneidensis hr.-1 med grønne fluorescens protein blev brugt som en model.

Abstract

Bakterielle biofilm er overflade-associerede Fællesskaber, der studeres langt for at forstå deres egen-producerede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) og deres roller i miljøet Mikrobiologi. Denne undersøgelse beskriver en metode til at dyrke biofilm vedhæftet fil system til analyse på flydende vakuum Interface (SALVI) og opnå i situ kemiske kortlægning af en levende biofilm ved time of flight sekundære ion massespektrometri (ToF-SIMS). Dette gøres gennem dyrkning af bakterier både uden for og inden for SALVI kanalen med vores specialiserede opsætning samt gennem optiske billeddannelse teknikker til at opdage biofilm tilstedeværelse og tykkelse før ToF-SIMS analyse. Vores resultater viser karakteristiske toppene af Shewanella biofilm i sin naturlige hydreret tilstand, fremhæve ved sin lokaliserede vand klyngemiljø samt EPS-fragmenter, der er drastisk anderledes fra den samme biofilm dehydreret stat. Disse resultater viser gennembrud evne til SALVI, der giver mulighed for i situ biofilm imaging med en vakuum-baserede kemiske imaging instrument.

Introduction

Bakterielle biofilm er overflade-associerede Fællesskaber, som har udviklet sig over tid som et forsvar for bakterier at overleve varierende negative fysiske og mekaniske stimuli, hvori celler er i stand til at vedhæfte og overleve i mange mulige miljøer. ^{1 , 2} biofilm undersøges langt og har anvendelsesmuligheder inden for mange områder som biomedicin, Biomedicinsk teknik, landbrug, og industriel forskning og udvikling. ^{1 , 2} forståelse den kemiske kortlægning af disse komplekse mikrobielle samfund, herunder deres egen-producerede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) og deres lokale vand-cluster miljø, er afgørende for at få en præcis og detaljeret skildring af deres biologiske aktiviteter. ²

Biofilm eksistere og vokse inden for en meget hydreret tilstand. Dette er en stor udfordring i at bruge vakuum-baserede overflade analyseteknikker såsom time of flight sekundære ion massespektrometri (ToF-SIMS) på grund af vanskeligheden ved at studere flygtige væsker i vakuum. Som et resultat, har vakuum-baserede overflade analyseteknikker været begrænset næsten udelukkende til at studere biofilm prøver på kun deres tørret tilstand. Dog hæmmer at studere en biofilm i tørret tilstand den nøjagtige undersøgelse af dens sande biologiske mikromiljø. Det bevirker ofte drastiske ændringer til EPS-integritet og biofilm morfologi, som er påvist efter sammenligner tør biofilm masse spektrale resultater i situ flydende undersøgelser. ^{3 , 4} i denne artikel præsenterer en løsning for at studere biofilm inden for deres naturlige hydreret tilstand ved at ansætte brug af vores System til analyse på flydende vakuum Interface (SALVI),^5,6 en mikrofluid reaktor der indeholder væske under sin tynde silicon nitride (synd) membran i en microchannel lavet af Polydimethylsiloxan (PMDS), således giver direkte adgang til sekundære ion sonde beam samtidig bibeholde den strukturelle integritet af den flydende matrix i et vakuum kammer. ^{7 , 8}

S. oneidensis hr.-1 muteret for at udtrykke grønne fluorescens protein (NGL) blev valgt som en model organisme for denne biofilm procedure illustration på grund af dens metaboliske alsidighed og fælles brug i miljøet og anvendt mikrobiologi, som var baseret stærkt på sin unikke kapacitet for metal reduktion og ekstracellulære elektron overførsel. ^{9 , 10 , 11} Derudover tilstedeværelsen af normal god landbrugspraksis tilladt for let løbende biofilm-tykkelse overvågning via Fluorescens mikroskopi, ved hjælp af en fluorescein isothiocyanat (FITC) filter. Vores tidligere undersøgelser har vist tegn på denne bakterier favorisere vedhæftet fil til vinduet synd bruger i operando fluorescens imaging til biofilm vækst til en tykkelse på op til 100 mikrometer. ^{4 , 12} mens dette papir vil kun diskutere bekræftelse af biofilm’s tilstedeværelse gennem Fluorescens mikroskopi, SALVI er kompatibel med andre optiske billeddannelse metoder såsom super-resolution fluorescens imaging (dvs. strukturerede belysning mikroskopi (SIM)⁹) og konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) imaging⁴). Optiske billeddannelse kan tjene til at måle biofilm tykkelse, og få en 3D-billede af formen af biofilm, som det vises, bekræfter dens tykkelse og dens tilknytning til vinduet synd. ⁹ mens normal god landbrugspraksis var brugte i SIMS analyse, S. oneidensis uden normal god landbrugspraksis var brugt i vækstkurven, som denne kun kræves måling af ekstinktionen og ikke kræver nogen fluorescerende billeddannelse. Generelt, forskellen mellem normal god landbrugspraksis mærket og umærket arter i vækstkurven er ubetydelig. Derudover, mens denne protokol bruger S. oneidensis hr.-1 NGL som en model organisme til at beskrive proceduren, er denne procedure designet til enhver bakteriel stamme, der kan være behov for dyrkning i SALVI. Selvom får kendskab til bakteriel stammen behov, muligvis nogle vækstbetingelser som tid, temperatur og ilt miljø skal ændres for at imødekomme stammen af bakterier til at blive brugt. For vækstmediet bruger denne procedure “nanowires” medium, tryptic soja bouillon (TSB) uden dextrose og tryptic soja agar (TSA) uden dextrose til dyrkning. Sammensætningen af “nanowires” medium har været specielt formuleret for væksten og for overvågning af udvidelser af membranen og periplasm af S. oneidensis , der synes at tage form af små ledninger, og de mellemstore sammensætning har været etableret i tidligere forskning. ^{13 , 14}

Vores tidligere protokollen om in situ flydende ToF-SIMS har illustreret den fordel, at SALVI har at tilbyde for protein immobilisering og tilknytning til synden, samt en detaljeret protokol om ToF-SIMS analyse og data reduktion. ¹² snarere end gentage data reduktion trin, dette papir vil tjene i stedet fokusere på den unikke tilgang af opsætning og dyrke biofilm inden for vores SALVI microchannel samt billedbehandling trin for at registrere biofilm tilstedeværelse og tykkelse forudgående ToF-SIMS analyse. Mens biofilm har tidligere været begrænset til kun tørrede prøver i kammeret af vakuum-baserede overflade analytiske teknikker, kan detaljeret EPS og biofilm kemiske kortlægning af levende biofilm nu fås i situ på grund af denne funktion.

Protocol

1. forberedelse af materialer Forberedelse af Medium slanger Serum flasker (en nødvendig pr. biofilm kultur og tre nødvendige per vækstkurve) Bemærk: som nævnt i indledningen, nogen vækst medium egner sig til at levere de næringsstoffer, der er nødvendige for stammen af bakterier af interesse kan udnyttes til denne procedure; i dette tilfælde, " nanowires " medier og TSB uden dextrose medium blev brugt til vækst af S. oneidensis hr.-1 NGL. <sup class="x…

Representative Results

Disse repræsentative resultater tjene til at vise hvordan den kemiske profil af den vedlagte biofilm kan identificeres og fortolket, som opnås gennem ToF-SIMS. Efter plotte massespektre fra ToF-SIMS dataopsamling, fremhævet kortvarigt i afsnittet procedurer bør peak identifikation gennemføres for at tildele hver respektive m/z værdi identiteter. Dette kan ske gennem omfattende litteraturgennemgang på massespektrometri på bakterier og specifikke kemiske fragmenter, der forventes at…

Discussion

Efter vaccination på log-fase, er det vigtigt at teste antallet dage og temperatur hvor biofilm bør vokse, før det er sundt og tyk nok for billeddannelse, som beskrevet i trin 3.1. Denne procedure omfatter specifikt dyrkning en S. oneidensis MR1 biofilm ved stuetemperatur; dog kan forskellige rumtemperaturer påvirke væksten. Derfor er det kritisk at bruge optisk imaging til at forstå om biofilm er klar, før du fortsætter til ToF-SIMS analyse. Forskellige stammer af bakterier kræver ligeledes forskellige vækstbe…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}