In Situ Caracterização de Shewanella oneidensis MR1 biofilmes por SALVI e ToF-SIMS

Summary

Este artigo apresenta um método para o cultivo de um biofilme para em situ íon secundário de tempo-de-voo espectrometria de massa para mapeamento químico em seu estado hidratado, habilitado por um reator microfluídicos, sistema para análise na Interface líquido do vácuo. A Shewanella oneidensis MR-1 com proteína de fluorescência verde foi usado como um modelo.

Abstract

Biofilmes bacterianos são comunidades de superfície associadas que são vastamente estudadas para entender suas auto-produzido substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e seus papéis em microbiologia ambiental. Este estudo descreve um método para cultivar apego de biofilme no sistema para análise na Interface líquido de vácuo (SALVI) e alcançar em situ mapeamento químico de um biofilme vivos por espectrometria de massa de iões secundário de tempo-de-voo (ToF-SIMS). Isto é feito através do cultivo de bactérias tanto fora como dentro do canal SALVI com nossa instalação especializada, bem como através de técnicas de imagem ópticas para detectar a presença de biofilme e espessura antes da análise de ToF-SIMS. Nossos resultados mostram os Picos característicos de biofilme a Shewanella em seu estado natural e hidratado, destacando em seu ambiente de cluster de água localizadas, bem como EPS fragmentos, que são drasticamente diferentes do biofilme a mesma desidratado Estado. Estes resultados demonstram a capacidade de descoberta de SALVI que permite em situ biofilme de imagem com um instrumento de imagem químico baseada em vácuo.

Introduction

Biofilmes bacterianos são comunidades associadas a superfície que evoluíram ao longo do tempo como uma defesa para que as bactérias sobrevivem variando adversos estímulos físicos e mecânicos, em que células são capazes de unir e sobreviver em muitos ambientes de possíveis. ^{1 , 2} biofilmes são vastamente investigados e têm aplicações em muitos campos tais como biomedicina, Engenharia Biomédica, agricultura e investigação industrial e desenvolvimento. ^{1 , 2} compreender o mapeamento químico dessas comunidades microbianas complexas, incluindo suas auto-produzido substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e o seu ambiente de cluster de água local, é essencial para ganhar uma exata e detalhada Descrição de suas atividades biológicas. ²

Biofilmes existirem e crescem dentro de um estado altamente hidratado. Isto representa um grande desafio na utilização de técnicas de análise de superfície baseada em vácuo como espectrometria de massa de iões secundário de tempo-de-voo (ToF-SIMS) devido à dificuldade em estudar líquidos voláteis no vácuo. Como resultado, técnicas de análise de superfície baseada em vácuo tem sido limitadas quase exclusivamente ao estudo de amostras de biofilme em apenas seu estado seco. No entanto, estudar um biofilme no seu estado seco inibe a investigação exata de sua verdade biológica microambiente. Muitas vezes provoca mudanças drásticas para a morfologia de integridade e biofilme EPS, que demonstrou-se depois de comparar resultados massa espectral biofilme seco em situ estudos líquido. ^{3 , 4} este artigo apresenta uma solução para o estudo de biofilmes dentro de seu estado hidratado natural empregando o uso de nosso sistema para análise na Interface líquido de vácuo (SALVI),^5,6 um reator microfluidic que contém líquido sob sua membrana de nitreto (pecado) de silicone fina em um microchannel feita de polidimetilsiloxano (SPDM), proporcionando acesso directo ao feixe de íon secundário de sonda, mantendo a integridade estrutural da matriz líquido dentro de um vácuo Câmara. ^{7 , 8}

S. oneidensis MR-1 mutado para expressar a proteína fluorescência verde (GFP) foi escolhido como um organismo modelo para esta ilustração do procedimento de biofilme devido à sua versatilidade metabólica e uso comum em microbiologia ambiental e aplicada, que foi baseado fortemente na sua capacidade única para redução de metal e a transferência de elétrons extracelular. ^{9 , 10 , 11} além disso, a presença de GFP permitido para fácil espessura biofilme contínua monitoramento através de microscopia de fluorescência, utilizando um filtro (FITC) de isotiocianato de fluoresceína. Nossos estudos anteriores mostraram evidências desta bactéria, favorecendo o apego à janela pecado utilizando em operando imagens de fluorescência para o crescimento do biofilme para uma espessura de até 100 micrômetros. ^{4 , 12} enquanto este artigo discutirá apenas a confirmação da presença do biofilme através de microscopia de fluorescência, a SALVI é compatível com outros métodos de imagem ópticos como super-resolução fluorescência imagem latente (ou seja, estruturada iluminação microscopia (SIM),⁹) e laser confocal, microscopia (CLSM) imagem⁴). Imagem latente ótica pode servir para medir a espessura do biofilme e obter uma imagem 3D, da forma do biofilme como parece, confirmando a sua espessura e a sua fixação para a janela do pecado. ⁹ enquanto GFP foi usado na análise SIMS, s. oneidensis sem GFP foi utilizado para a curva de crescimento, como esta única medida necessária de densidade óptica e não exigem qualquer imagem fluorescente. Geralmente, a diferença entre o GFP marcados e espécies não marcados na curva de crescimento é insignificante. Além disso, enquanto este protocolo usa S. oneidensis MR-1 GFP como um organismo modelo para descrever o procedimento, este procedimento é projetado para qualquer estirpe bacteriana que pode ser necessário para o cultivo dentro SALVI. Embora, dado o conhecimento da estirpe bacteriana necessária, algumas condições de crescimento, tais como tempo, temperatura e oxigênio ambiente talvez precise ser modificado para acomodar a cepa de bactérias para ser usado. Por meio de crescimento, este procedimento usa “nanofios” médio, tryptic soy caldo de carne (TSB) sem glicose e tryptic soy agar (TSA) sem glicose para cultivo. A composição do meio de “nanofios”, foi especialmente formulada para o crescimento e para o monitoramento de extensões da membrana e periplasm de S. oneidensis que parecem tomar a forma de pequenos fios e a composição média tem sido estabelecida na pesquisa anterior. ^{13 , 14}

Nosso protocolo anterior em in situ ToF-SIMS líquido ilustrou o benefício que SALVI tem para oferecer para imobilização de proteínas e acessório para o pecado, bem como um protocolo detalhado na redução de dados e análise de ToF-SIMS. ¹² em vez de reiterar as etapas de redução de dados, este documento servirá para em vez disso, focar a abordagem única de criação e cultivando biofilmes dentro nosso microchannel SALVI, bem como as etapas de imagem para detectar a presença de biofilme e espessura prévia a análise de ToF-SIMS. Enquanto biofilmes têm sido anteriormente limitados a apenas secas amostras dentro da câmara de técnicas analíticas de superfície baseada em vácuo, mapeamento detalhado EPS e biofilme químico de biofilmes ao vivo agora pode ser obtido em situ por causa deste novo recurso.

Protocol

1. preparação de materiais Preparação do tubo médio garrafas de soro (um necessários por cultura de biofilme e três necessários por curva de crescimento) Nota: como mencionado na introdução, qualquer crescimento meio apropriado para fornecer os nutrientes necessários para a cepa de bactérias de interesse pode ser utilizado para este procedimento; Neste caso, " os nanofios " mídia e TSB sem médio de glicose foi usado para o crescimento da S. oneidensis</e…

Representative Results

Estes resultados representativos servem para mostrar como o perfil químico do biofilme anexado pode ser identificado e interpretado, como obtidas por ToF-SIMS. Após a plotagem de espectros de massa de aquisição de dados de ToF-SIMS, destacada-se brevemente na seção procedimentos, identificação de pico deve ser conduzida para atribuir as identidades para cada valor de m/z respectivos. Isso pode ser feito através da revisão de literatura extensa na espectrometria de massa em bact?…

Discussion

Após inocular em fase de registro, é importante testar o número de dias e a temperatura na qual o biofilme deve crescer antes que seja saudável e grossa o suficiente para a imagem latente, conforme descrito na etapa 3.1. Este procedimento abrange especificamente cultivo um S. oneidensis MR1 biofilme à temperatura ambiente; no entanto, diferentes temperaturas de quarto pode influenciar a taxa de crescimento. Portanto, é fundamental usar imagens ópticas para entender se o biofilme está pronto antes de proceder à a…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}