In Situ Caracterización de Shewanella oneidensis MR1 Biofilms por SALVI y ToF-SIMS

Summary

Este artículo presenta un método para el crecimiento de la biopelícula para en situ ion secundaria tiempo de vuelo espectrometría para mapeo químico en su estado hidratado, habilitado por un reactor de microfluidos, sistema para el análisis en la interfase líquida del vacío. La Shewanella oneidensis MR-1 con la proteína de fluorescencia verde fue utilizado como un modelo.

Abstract

Biofilms bacterianos son comunidades asociadas de superficie que se estudian mucho para entender sus propia sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y sus papeles en Microbiología Ambiental. Este estudio describe un método para cultivar el apego de biofilm en el sistema para el análisis en la interfaz de vacío líquido (SALVI) y lograr en situ química asignación de una biopelícula de vida por spectrometry total de ion secundario de tiempo de vuelo (ToF-SIMS). Esto se hace mediante el cultivo de bacterias tanto fuera como dentro del canal SALVI con nuestra instalación especializada, así como a través de técnicas de imagen ópticas para detectar la presencia de biofilm y espesor antes del análisis de ToF-SIMS. Nuestros resultados muestran los picos característicos de la biopelícula de Shewanella en su estado hidratado natural, destacando en su entorno de clúster de agua localizada, así como la EPS fragmentos, que son drásticamente diferentes de la misma biopelícula deshidratado Estado. Estos resultados demuestran la capacidad de avance de SALVI que permite imágenes de biofilm en situ con un instrumento de proyección de imagen química basado en el vacío.

Introduction

Biofilms bacterianos son comunidades asociadas de superficie que han evolucionado como una defensa de las bacterias sobrevivir a diversos estímulos físicos y mecánicos adversos, en donde las células son capaces de conectar y sobrevivir en muchos ambientes posibles. ^{1 , 2} Biofilms son ampliamente investigados y tienen aplicaciones en muchos campos como la biomedicina, ingeniería biomédica, agricultura y la investigación industrial y desarrollo. ^{1 , 2} entender la cartografía química de estas complejas comunidades microbianas, incluyendo sus propia sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y su entorno de clúster de agua local, es esencial para obtener una precisa y detallada representación de sus actividades biológicas. ²

Biofilms existen y crecen dentro de un estado altamente hidratado. Esto presenta un gran desafío en el uso de técnicas de análisis superficial basado en el vacío por ejemplo spectrometry total de ion secundario de tiempo de vuelo (ToF-SIMS) debido a la dificultad en el estudio de líquidos volátiles en vacío. Como resultado, técnicas de análisis de superficies basadas en vacío se han limitado casi exclusivamente al estudio de las muestras de la biopelícula en estado seco. Sin embargo, estudiar un biofilm en su estado seco inhibe la investigación precisa de su microambiente biológico verdadero. A menudo causa cambios drásticos en la morfología EPS integridad y biofilm, que se ha demostrado después de comparar resultados masa espectral biofilm seco en situ estudios de líquido. ^{3 , 4} este artículo presenta una solución para el estudio de biofilms en su estado hidratado natural empleando el uso de nuestro sistema para el análisis en la interfaz de vacío líquido (SALVI),^5,6 un reactor de microfluidos que contiene líquido en su membrana de nitruro (pecado) de silicio fino en un microcanal de polidimetilsiloxano (MBAS), proporcionando así acceso directo a la viga de ion secundario sonda mientras mantiene la integridad estructural de la matriz líquida dentro de un vacío cámara. ^{7 , 8}

S. oneidensis MR-1 mutado para expresar la proteína de fluorescencia verde (GFP) fue elegido como un organismo modelo para esta ilustración del procedimiento de biopelícula debido a su versatilidad metabólica y de uso común en Microbiología Ambiental y aplicada, que se basa en su capacidad única para la reducción del metal y la transferencia de electrones extracelular. ^{9 , 10 , 11} Adicionalmente, la presencia de la GFP permite fácil continua biofilm-espesor de monitoreo a través de microscopía de fluorescencia, utilizando un filtro de fluoresceína isotiocianato (FITC). Nuestros estudios previos han mostrado evidencia de esta bacterias favoreciendo el apego a la ventana del pecado usando en operando imágenes de fluorescencia para el crecimiento de biofilm en un espesor de hasta cien micrómetros. ^{4 , 12} si bien este artículo discutirá solamente la confirmación de la presencia de biofilm mediante microscopía de fluorescencia, el SALVI es compatible con otros métodos de proyección de imagen ópticas como la estupendo-resolución imágenes de fluorescencia (es decir, estructurada iluminación microscopia (SIM)⁹) y el láser confocal de barrido microscopía (CLSM) imagen⁴). Imágenes ópticas pueden servir para medir el espesor de la biopelícula y obtener una imagen 3D de la forma de la biopelícula como parece, confirmando su grosor y su fijación a la ventana de pecado. ⁹ mientras GFP fue utilizado en el análisis de los SIMS, S. oneidensis sin GFP fue utilizado para la curva de crecimiento, como esta única medición de la densidad óptica y no requieren ninguna imagen fluorescente. Generalmente, la diferencia entre la GFP etiquetadas y especies sin etiquetar en la curva de crecimiento es insignificante. Además, mientras que este protocolo usa S. oneidensis MR-1 GFP como un organismo modelo para describir el procedimiento, este procedimiento está diseñado para cualquier cepa bacteriana que puede ser necesario para el cultivo dentro de SALVI. Aunque, dado el conocimiento de la cepa bacteriana es necesario, unas condiciones de crecimiento tales como tiempo, temperatura y oxígeno ambiente deba ser modificado para dar cabida a la cepa de bacterias para ser utilizado. Por medio del crecimiento, este procedimiento utiliza para el cultivo de caldo de soja tríptica, medio de “nanocables” (TSB) sin dextrosa y agar soja tríptico (CST) sin dextrosa. La composición del medio de “nanocables” ha sido especialmente formulada para el crecimiento y para el monitoreo de las extensiones de la membrana y periplasma de S. oneidensis que parecen tomar la forma de pequeños hilos y la composición media ha sido establecido en investigaciones anteriores. ^{13 , 14}

Nuestro protocolo anterior en in situ líquido ToF-SIMS ha ilustrado el beneficio que SALVI ofrece para inmovilización de la proteína y el apego al pecado, así como un protocolo detallado en ToF-SIMS análisis y reducción de datos. ¹² en lugar de reiterar medidas de reducción de datos, este documento servirá para centrarse en cambio en el enfoque único de establecer y cultivar biofilms dentro de nuestra MCP SALVI, así como los proyección de imagen pasos para detectar presencia de biofilm y espesor previo a análisis de ToF-SIMS. Mientras que anteriormente ya se habían limitados los biofilms que para sólo secar muestras dentro de la cámara de vacío base superficie técnicas analíticas, detallada cartografía química EPS y biofilm de biofilms vivo puede ahora obtener en situ debido a esta nueva capacidad.

Protocol

1. preparación de materiales botellas de suero (una necesaria cultura del biofilm y tres necesitan por curva de crecimiento) la Preparación de medio tubo Nota: como se mencionó en la introducción, crecimiento medio adecuado para proporcionar los nutrientes necesarios para la cepa de bacterias de interés puede ser utilizado para este procedimiento; en este caso, " nanohilos " medios de comunicación y TSB sin medio dextrosa fue utilizado para el crecimiento de S. …

Representative Results

Estos resultados representativos sirven para mostrar cómo se puede identificar e interpretado, el perfil químico de la biopelícula adjunto obtenido a través de ToF-SIMS. Después de trazar los espectros de masas de adquisición de datos de ToF-SIMS, destacada brevemente en la sección de procedimientos, identificación de pico debe realizarse con el fin de asignar identidades a cada valor de m/z respectivos. Esto puede hacerse a través de la revisión de literatura extensa sobre espe…

Discussion

Después de inocular en la fase de registro, es importante comprobar el número de días y la temperatura en la cual el biofilm debe crecer antes de que sea saludable y lo suficientemente gruesa como para la proyección de imagen, como se describe en el paso 3.1. Este procedimiento cubre específicamente el cultivo un S. oneidensis MR1 biofilm a temperatura ambiente; sin embargo diferentes temperaturas ambiente puede influir en la tasa de crecimiento. Por lo tanto, es fundamental utilizar la proyección de imagen óptica…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}