Denne artikel præsenterer en metode til dyrkning af en biofilm for i situ time of flight sekundære ion massespektrometri for kemiske kortlægning i sin hydreret tilstand er aktiveret af et mikrofluid reaktor, System til analyse på grænsefladen flydende vakuum. Shewanella oneidensis hr.-1 med grønne fluorescens protein blev brugt som en model.
Bakterielle biofilm er overflade-associerede Fællesskaber, der studeres langt for at forstå deres egen-producerede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) og deres roller i miljøet Mikrobiologi. Denne undersøgelse beskriver en metode til at dyrke biofilm vedhæftet fil system til analyse på flydende vakuum Interface (SALVI) og opnå i situ kemiske kortlægning af en levende biofilm ved time of flight sekundære ion massespektrometri (ToF-SIMS). Dette gøres gennem dyrkning af bakterier både uden for og inden for SALVI kanalen med vores specialiserede opsætning samt gennem optiske billeddannelse teknikker til at opdage biofilm tilstedeværelse og tykkelse før ToF-SIMS analyse. Vores resultater viser karakteristiske toppene af Shewanella biofilm i sin naturlige hydreret tilstand, fremhæve ved sin lokaliserede vand klyngemiljø samt EPS-fragmenter, der er drastisk anderledes fra den samme biofilm dehydreret stat. Disse resultater viser gennembrud evne til SALVI, der giver mulighed for i situ biofilm imaging med en vakuum-baserede kemiske imaging instrument.
Bakterielle biofilm er overflade-associerede Fællesskaber, som har udviklet sig over tid som et forsvar for bakterier at overleve varierende negative fysiske og mekaniske stimuli, hvori celler er i stand til at vedhæfte og overleve i mange mulige miljøer. 1 , 2 biofilm undersøges langt og har anvendelsesmuligheder inden for mange områder som biomedicin, Biomedicinsk teknik, landbrug, og industriel forskning og udvikling. 1 , 2 forståelse den kemiske kortlægning af disse komplekse mikrobielle samfund, herunder deres egen-producerede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) og deres lokale vand-cluster miljø, er afgørende for at få en præcis og detaljeret skildring af deres biologiske aktiviteter. 2
Biofilm eksistere og vokse inden for en meget hydreret tilstand. Dette er en stor udfordring i at bruge vakuum-baserede overflade analyseteknikker såsom time of flight sekundære ion massespektrometri (ToF-SIMS) på grund af vanskeligheden ved at studere flygtige væsker i vakuum. Som et resultat, har vakuum-baserede overflade analyseteknikker været begrænset næsten udelukkende til at studere biofilm prøver på kun deres tørret tilstand. Dog hæmmer at studere en biofilm i tørret tilstand den nøjagtige undersøgelse af dens sande biologiske mikromiljø. Det bevirker ofte drastiske ændringer til EPS-integritet og biofilm morfologi, som er påvist efter sammenligner tør biofilm masse spektrale resultater i situ flydende undersøgelser. 3 , 4 i denne artikel præsenterer en løsning for at studere biofilm inden for deres naturlige hydreret tilstand ved at ansætte brug af vores System til analyse på flydende vakuum Interface (SALVI),5,6 en mikrofluid reaktor der indeholder væske under sin tynde silicon nitride (synd) membran i en microchannel lavet af Polydimethylsiloxan (PMDS), således giver direkte adgang til sekundære ion sonde beam samtidig bibeholde den strukturelle integritet af den flydende matrix i et vakuum kammer. 7 , 8
S. oneidensis hr.-1 muteret for at udtrykke grønne fluorescens protein (NGL) blev valgt som en model organisme for denne biofilm procedure illustration på grund af dens metaboliske alsidighed og fælles brug i miljøet og anvendt mikrobiologi, som var baseret stærkt på sin unikke kapacitet for metal reduktion og ekstracellulære elektron overførsel. 9 , 10 , 11 Derudover tilstedeværelsen af normal god landbrugspraksis tilladt for let løbende biofilm-tykkelse overvågning via Fluorescens mikroskopi, ved hjælp af en fluorescein isothiocyanat (FITC) filter. Vores tidligere undersøgelser har vist tegn på denne bakterier favorisere vedhæftet fil til vinduet synd bruger i operando fluorescens imaging til biofilm vækst til en tykkelse på op til 100 mikrometer. 4 , 12 mens dette papir vil kun diskutere bekræftelse af biofilm’s tilstedeværelse gennem Fluorescens mikroskopi, SALVI er kompatibel med andre optiske billeddannelse metoder såsom super-resolution fluorescens imaging (dvs. strukturerede belysning mikroskopi (SIM)9) og konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) imaging4). Optiske billeddannelse kan tjene til at måle biofilm tykkelse, og få en 3D-billede af formen af biofilm, som det vises, bekræfter dens tykkelse og dens tilknytning til vinduet synd. 9 mens normal god landbrugspraksis var brugte i SIMS analyse, S. oneidensis uden normal god landbrugspraksis var brugt i vækstkurven, som denne kun kræves måling af ekstinktionen og ikke kræver nogen fluorescerende billeddannelse. Generelt, forskellen mellem normal god landbrugspraksis mærket og umærket arter i vækstkurven er ubetydelig. Derudover, mens denne protokol bruger S. oneidensis hr.-1 NGL som en model organisme til at beskrive proceduren, er denne procedure designet til enhver bakteriel stamme, der kan være behov for dyrkning i SALVI. Selvom får kendskab til bakteriel stammen behov, muligvis nogle vækstbetingelser som tid, temperatur og ilt miljø skal ændres for at imødekomme stammen af bakterier til at blive brugt. For vækstmediet bruger denne procedure “nanowires” medium, tryptic soja bouillon (TSB) uden dextrose og tryptic soja agar (TSA) uden dextrose til dyrkning. Sammensætningen af “nanowires” medium har været specielt formuleret for væksten og for overvågning af udvidelser af membranen og periplasm af S. oneidensis , der synes at tage form af små ledninger, og de mellemstore sammensætning har været etableret i tidligere forskning. 13 , 14
Vores tidligere protokollen om in situ flydende ToF-SIMS har illustreret den fordel, at SALVI har at tilbyde for protein immobilisering og tilknytning til synden, samt en detaljeret protokol om ToF-SIMS analyse og data reduktion. 12 snarere end gentage data reduktion trin, dette papir vil tjene i stedet fokusere på den unikke tilgang af opsætning og dyrke biofilm inden for vores SALVI microchannel samt billedbehandling trin for at registrere biofilm tilstedeværelse og tykkelse forudgående ToF-SIMS analyse. Mens biofilm har tidligere været begrænset til kun tørrede prøver i kammeret af vakuum-baserede overflade analytiske teknikker, kan detaljeret EPS og biofilm kemiske kortlægning af levende biofilm nu fås i situ på grund af denne funktion.
Efter vaccination på log-fase, er det vigtigt at teste antallet dage og temperatur hvor biofilm bør vokse, før det er sundt og tyk nok for billeddannelse, som beskrevet i trin 3.1. Denne procedure omfatter specifikt dyrkning en S. oneidensis MR1 biofilm ved stuetemperatur; dog kan forskellige rumtemperaturer påvirke væksten. Derfor er det kritisk at bruge optisk imaging til at forstå om biofilm er klar, før du fortsætter til ToF-SIMS analyse. Forskellige stammer af bakterier kræver ligeledes forskellige vækstbe…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) jorden og biologiske videnskaber (EBD) mission frø laboratorium instrueret forskning og udvikling (LDRD) Fonden for støtte. Medvirkende var adgang gennem et W. R. Wiley miljømæssige Molecular Sciences Laboratory (EMSL) generel bruger forslag. EMSL er en national videnskabelig bruger facilitet sponsoreret af Office af biologiske og miljømæssige forskning (BER) på PNNL. Forfatterne takke Dr. Yuanzhao Ding for bevis læsning af manuskript og giver nyttig feedback. PNNL drives af Battelle for DOE under kontrakt DE-AC05-76RL01830.
ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution |
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
-80°C Freezer | New Brunswick Scientific | N/A | U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer |
4°C Refrigerator | BioCold Scientific | N/A | COLDBOX1 |
Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | N/A | Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm. |
Syringe Pump | Cole-Parmer | EW-74905-02 | Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate. |
Incubator | Barnstead International | LT1465X3 | Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing. |
Autoclave | Getinge | 533LS | Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 4001-000 | GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves. |
Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1385 | 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet |
Fluorescence Microscope | Nikon | N/A | Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply. |
pH Meter | Mettler Toledo | 51302803 | Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving. |
PEEK Union | Valco | ZU1TPK | For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system. |
5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS. |
Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 µL. |
Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL pipette tips |
Razor Blade Handle | Stanley | N/A | Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing |
Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
Syringe | BD | 309657 | 3 mL |
Syringe | BD | 309646 | 5 mL; Used for making the drip chamber |
Syringe | BD | 309604 | 10 mL |
Syringe | BD | 302830 | 20 mL |
Disposable Pipette | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles. |
Electric Pipette Filler | Pipet-aid | P-57260 | Vacuum pressure electric serological pipette filler |
Serum Bottle | Sigma | 33109-U | Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle. |
Anaerobic Culture Tube | VWR | 89167-178 | Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal. |
Rubber Stopper | Sigma | 27235-U | Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber. |
Aluminum Crimp Seal (without septum) | Sigma | 27227-U | Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper. |
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper | Wheaton | 224307 | 30 mm crimper with standard seal. |
PTFE Tubing | Supelco | 58697-U | 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system. |
Disposable Cuvettes | GMBH | 759085D | 1.5 Ml for use with spectrophotometer. |
Needle | BD | 303015 | 22G; used for serum bottle injection. |
Needle | BD | 305120 | 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system. |
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP | N/A | N/A | Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
TSA | BD | 212305 | Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol |
PIPES Buffer | Sigma | P-1851 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Hydroxide | Sigma | S-5881 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Ammonium Chloride | Sigma | A-5666 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Potassium Chloride | Sigma | P-4504 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S-9638 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium lactate | Sigma | L-1375 | 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt | Sigma | N-0253 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron (III) Chloride | Sigma | 451649 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Magnesium Sulfate | Sigma | 208094 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Manganese (II) Sulfate Monohydrate | Sigma | M-7634 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Sigma | 215422 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Cobalt(II) Chloride | Sigma | 60818 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Zinc Chloride | Sigma | 229997 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Copper(II) Sulfate Pentahydrate | Sigma | C-8027 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate | Sigma | 237086 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Boric Acid | Sigma | B-6768 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Molybdate Dihydrate | Sigma | 331058 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nickel(II) Chloride | Sigma | 339350 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Tungstate Dihydrate | Sigma | 14304 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Biotin | Sigma | 47868 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Folic Acid | Sigma | F-7876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Pyridoxine Hydrochloride | Sigma | P-9755 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Riboflavin (B2) | Sigma | 47861 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thiamine Hydrochloride | Sigma | T-4625 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nicotinic Acid | Sigma | N4126 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt | Sigma | 21210 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Vitamin B12 | Sigma | V-2876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
4-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |