इष्टतम गुणसूत्र स्थान का निर्धारण (ओं) एक डीएनए तत्व के लिए एक उपंयास Transposon-मध्यस्थता दृष्टिकोण का उपयोग कर ई कोलाई में
Summary
यहां, एक गैर की एक transposon-मध्यस्थता यादृच्छिक प्रविष्टि की सत्ता में डीएनए तत्व कोडिंग के लिए अपनी इष्टतम गुणसूत्र स्थिति को हल किया गया था ।
Abstract
एक दिया डीएनए तत्व की इष्टतम गुणसूत्र स्थिति (ओं) था/transposon द्वारा निर्धारित किया गया था यादृच्छिक फिटनेस चयन द्वारा पीछा सम्मिलन । जीवाणुओं में आनुवांशिक तत्व के कार्य पर आनुवांशिक सन्दर्भ के प्रभाव का आंकलन करना कठिन हो सकता है । टोपोलॉजिकल प्रभाव सहित कई तंत्र, पड़ोसी जीन से हस्तक्षेप transcriptional, और/या प्रतिकृति से संबंधित जीन खुराक, एक दिया आनुवंशिक तत्व के समारोह को प्रभावित कर सकते हैं । यहाँ, हम ई कोलाई के गुणसूत्र में एक डीएनए तत्व के यादृच्छिक एकीकरण परमिट और सबसे अनुकूल एक साधारण विकास प्रतियोगिता प्रयोग का उपयोग स्थानों का चयन एक विधि का वर्णन । विधि यादृच्छिक प्रविष्टि के एक अच्छी तरह से वर्णित transposon आधारित प्रणाली का लाभ लेता है, विकास लाभ, एक प्रक्रिया है कि आसानी से प्रयोगात्मक जरूरतों के लिए समायोज्य है द्वारा फिटर क्लोन (एस) की एक चयन के साथ युग्मित । फिटर क्लोन (ओं) की प्रकृति एक जटिल बहु-क्लोनल जनसंख्या पर पूरे जीनोम अनुक्रमण द्वारा या चयनित क्लोनों की तेजी से पहचान के लिए आसान जीन घूमना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । यहां, गैर कोडिंग डीएनए क्षेत्र DARS2, जो ई. कोलाईमें गुणसूत्र प्रतिकृति की दीक्षा को नियंत्रित करता है, एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । DARS2 का फ़ंक्शन प्रतिकृति से संबंधित जीन खुराक से प्रभावित होने के लिए जाना जाता है; करीब DARS2 डीएनए प्रतिकृति के मूल करने के लिए हो जाता है, और अधिक सक्रिय हो जाता है । DARS2 बेतरतीब ढंग से एक DARS2-हटाए गए तनाव के गुणसूत्र में डाला गया था । परिणामी क्लोनों युक्त व्यक्तिगत सम्मिलन थे और पीढ़ियों के सैकड़ों के लिए एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा । अंत में, फिटर क्लोन विशेषता और मूल DARS2 स्थान के करीब निकटता में डाला DARS2 शामिल करने के लिए पाया गया.
Introduction
किसी भी आनुवंशिक तत्व का कार्य जीनोम में उसके स्थान से प्रभावित हो सकता है. बैक्टीरिया में, यह मुख्य रूप से हस्तक्षेप से पड़ोसी जीन की प्रतिलिपि द्वारा परिणाम, स्थानीय डीएनए टोपोलॉजी, और/या प्रतिकृति से जुड़े जीन खुराक । विशेष रूप से, डीएनए प्रतिकृतिकरण और अलगाव की प्रक्रिया को नियंत्रित कर रहे हैं, कम से कम भाग में, गैर द्वारा कोडिंग गुणसूत्र क्षेत्रों1, और इन क्षेत्रों के उचित कार्य जीनोमिक स्थान पर निर्भर करता है/ ई. कोलाईमें, उदाहरण dif साइट, बहन गुणसूत्र संकल्प2के लिए आवश्यक हैं; KOPS दृश्यों, गुणसूत्र अलगाव के लिए आवश्यक3; और डेटा, DARS1, और DARS2 क्षेत्रों, उचित गुणसूत्र प्रतिकृति नियंत्रण के लिए आवश्यक (नीचे; 4). हम एक यादृच्छिक स्थानांतरण, चयन, और किसी भी आनुवंशिक तत्व के इष्टतम आनुवंशिक संदर्भ के निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए विधि वर्तमान, DARS2 गैर कोडिंग क्षेत्र के अध्ययन के द्वारा यहां उदाहरण ।
ई. कोलाई में, DnaA एक प्रतिकृति मूल में डीएनए कतरा खोलने के लिए जिंमेदार सर्जक प्रोटीन है, oriC, और helicase DnaB5,6,7की भर्ती के लिए । DnaA एएए के अंतर्गत आता है+ (यानी, ATPases विविध गतिविधियों के साथ जुड़े) प्रोटीन और दोनों एटीपी और ADP समान उच्च समानताएं5के साथ बांध कर सकते हैं । DnaAएटीपी चोटियों के स्तर पर दीक्षा8, जहां DnaAएटीपी रूपों oriC पर एक multimer है कि डीएनए द्वैध9खोलने से चलाता है । दीक्षा के बाद, oriC के लिए अस्थाई रूप से उपलब्ध कराया है पुनः के लिए एक SeqA प्रोटीन के बंधन को शामिल तंत्र द्वारा ज़ब्ती के कारण दीक्षा के लिए hemimethylated oriC10,11। ज़ब्ती के दौरान, DnaAएटीपी के स्तर पर कम से कम दो तंत्र से कम है: DnaA (रिदा)12,13 और डेटाके विनियामक निष्क्रियता-आश्रित DnaAएटीपी hydrolysis (DDAH)14 ,15. दोनों रिदा और DDAH DnaAएटीपी के रूपांतरण को बढ़ावा देने के लिए DnaAADP। दीक्षा के एक नए दौर से पहले, DnaAADP फिर से सक्रिय है विशिष्ट DnaA पर DnaAएटीपी -reएक्टिवेट अनुक्रम (डारों): DARS1 और DARS216,17। गुणसूत्र डेटा, DARS1,और DARS2 क्षेत्रों गैर कोडिंग कर रहे है और एक निगरानी तरह तरीके में कार्य करने के लिए DnaAएटीपी/DnaAADP रूपांतरण मिलाना । इन क्षेत्रों, प्रतिकृति के मूल के बाहर स्थित, या तो निष्क्रियण (डेटाके लिए एक DnaA परिसर के असेंबली सक्षम करें; 14) या सक्रियण (DARS1 और DARS2; १७) च्या DnaA. किसी कक्ष में DARS2 हटाना सामूहिक दोहरीकरण समय को परिवर्तित नहीं करता है लेकिन एसिंक्रोनस प्रतिकृति दीक्षा15,16,18में परिणाम । हालांकि, DARS2-कमी कोशिकाओं एक फिटनेस लागत अमीर माध्यम में दोनों निरंतर वृद्धि प्रतियोगिता के दौरान या माउस आंत में औपनिवेशीकरण की स्थापना के दौरान एक अंयथा isogenic wildtype की तुलना में18है । यह इंगित करता है कि asynchrony/मूल एकाग्रता में भी मामूली परिवर्तन बैक्टीरियल फिटनेस पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ता है । ई. कोलाईमें, वहां एक चयनात्मक को गुणसूत्र समरूपता (यानी, दो लगभग बराबर लंबाई प्रतिकृति शस्त्र) बनाए रखने के दबाव है19। डेटा, DARS1, और DARS2 क्षेत्रों में सभी ई. कोलाई उपभेदों में oriC के लिए एक ही रिश्तेदार दूरी है18अनुक्रम, गुणसूत्र आकार में बड़े बदलाव के बावजूद ।
यहां, हम ई. कोलाई के DARS2 क्षेत्र गुणसूत्र स्थिति (ओं) को अपने समारोह के लिए इष्टतम की पहचान के लिए एक उदाहरण के रूप में उपयोग करें । DARS2 NKBOR transposon में डाला गया था, और परिणामी NKBOR::DARS2 transposon बाद में MG1655 ΔDARS2के जीनोम में बेतरतीब ढंग से डाला । हम इस प्रकार कोशिकाओं का एक संग्रह उत्पंन, प्रत्येक रखने DARS2 गुणसूत्र पर एक अलग स्थान पर रखा । एक इन विट्रो प्रतियोगिता प्रयोग, जहां संग्रह में सभी कोशिकाओं और परित एक अनुमानित ७०० पीढ़ियों के लिए पौंड में लगातार वृद्धि के दौरान एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा, प्रदर्शन किया गया था । प्रतियोगिता प्रयोग के परिणाम पर नजर रखी थी/दक्षिणी दाग, आसान जीन घूमना, और पूरे जीनोम अनुक्रमण का उपयोग कर निर्धारित (WGS; चित्र 1) । आसान जीन घूमना द्वारा हल अंत बिंदु क्लोन सेल चक्र मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विशेषता थे. एक प्रवाह cytometric विश्लेषण में, सेल आकार, डीएनए सामग्री, और दीक्षा synchrony कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के लिए मापा जा सकता है । प्रवाह cytometry के दौरान, एकल कोशिकाओं के प्रवाह के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य के एक प्रकाश बीम गुजरता है दाग डीएनए है, जो एक साथ photomultipliers द्वारा पंजीकृत है कि उत्सर्जित प्रतिदीप्ति, डीएनए सामग्री का एक उपाय है, बशर्ते कि इकट्ठा उत्तेजित कोशिकाओं के डीएनए के लिए दाग रहे हैं । आगे-बिखरी रोशनी का उपाय है सेल मास20।
इन विट्रो प्रतियोगिता प्रयोग हम यहां मौजूद आनुवंशिक तत्व के गुणसूत्र स्थिति और जीनोमिक संदर्भ के महत्व से संबंधित सवालों के पते के लिए प्रयोग किया जाता है । विधि निष्पक्ष और प्रयोग करने में आसान है ।
Protocol
1. Transposon लाइब्रेरी का संग्रह
नोट: गुणसूत्र DARS2 लोकस में क्लोन किया गया था मिनी तमिलनाडु 10 -आधारित Transposon, NKBOR (on pNKBOR) 21 , जिसके परिणामस्वरूप NKBOR:: DARS2 (pJFM1) । pNKBOR ऑनलाइन प्राप्त किया …
Representative Results
Discussion
यहां इस्तेमाल किया पद्धति राज्य के अत्याधुनिक तकनीकों का लाभ लेता है एक आनुवंशिक तत्व के इष्टतम जीनोमिक स्थिति के बारे में एक कठिन सवाल का जवाब । आनुवंशिक तत्व के यादृच्छिक सम्मिलन (transposon द्वारा मध्यस्…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक नोवो Nordisk फाउंडेशन, Lundbeck फाउंडेशन से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया, और डेनमार्क के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (DNRF120) बैक्टीरियल तनाव प्रतिक्रिया और हठ (बसप) के लिए केंद्र के माध्यम से ।
Materials
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
Riferimenti
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