建立双抗 EGFR-使用 tki 药物治疗和满足使用 tki 药物治疗在肺腺癌细胞体外与 2 步剂量升级程序
Summary
在体外建立双抗 EGFR-使用 tki 药物治疗和癌症细胞中大都会使用 tki 药物治疗方法。此方法是用于开发陈列尽管大都会放大 EGFR-使用 tki 药物治疗治疗疾病进展的 EGFR 突变，患者的治疗方法。它也可以修改为针对其他分子的抑制剂。
Abstract
耐药是在癌症治疗中的一项重大挑战。耐药株在体外生成是发现新的机制，以克服这一挑战的必要条件。在这里，一种建立双电阻对表皮生长因子受体 (EGFR) 的 2 步剂量升级方法-酪氨酸激酶抑制剂 （使用 tki 药物治疗）、 吉非替尼和大都会-使用 tki 药物治疗，PHA665752，描述。这种方法基于简单逐步剂量递增抑制剂诱导的获得性抗性细胞系。产生耐药株的备用方法涉及细胞暴露于高浓度抑制剂中的一步。逐步的剂量递增方法具有更高的成功诱导可能性获得性抗性比这种方法。激活 EGFR 突变是响应与 EGFR-使用 tki 药物治疗，治疗的生物标志物应用的一线治疗非小细胞肺癌 (NSCLC)，那怀有这些突变。然而，尽管作出有效反应的报告，EGFR-使用 tki 药物治疗使用是有限因为肿瘤不可避免地获得耐药性。EGFR-使用 tki 药物治疗抵抗背后的主要机制包括看门人网站、 在 EGFR 外显子 20 T790M 和大都会旁路信号二次突变。因此，为这一问题的潜在解决方案将结合 EGFR-使用 tki 药物治疗和大都会-使用 tki 药物治疗。这个综合的治疗已被证明是有效的体外研究模型。获得性吉非替尼耐通过 MET 放大而成立的逐步剂量递增的吉非替尼治疗 12 个月，命名为 PC 9MET1000 细胞株在先前的研究中生成。进一步探讨获得性的 MET-使用 tki 药物治疗和 EGFR-使用 tki 药物治疗的机制抵抗，大都会-使用 tki 药物治疗，PHA665752，管理，给这些细胞逐步剂量递增吉非替尼在为 12 个月。本议定书也成功地适用于组合疗法建立获得性的耐药其他抑制剂分子的数目。
Introduction
致癌性突变中表皮生长因子受体 (EGFR) 发现在非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者的一个子集，重要预测生物标记物此疾病1，2。这些最常用激活 EGFR 突变发生作为帧中删除在 19 号外显子 (delE746-A750) 或替换亮氨酸与精氨酸的外显子 (存在 L858R) 21 号 858 密码在 EGFR 酪氨酸激酶域3，4点突变。窝藏 EGFR 突变的非小细胞肺癌患者的临床有效治疗是治疗 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 （测出）。然而，这种疗法被受到限制抗 EGFR 测出吉非替尼和埃罗替尼等必然采集。最常见的获得性耐药发生，通过二次 T790M 突变基因外显子 20 的 EGFR，大约 60%的患者获得 EGFR-使用 tki 药物治疗 （吉非替尼或厄洛替尼） 电阻检测到。其他伴 EGFR 测出获得性耐药的分子机制并激活的旁路信号引起的大都会放大，转型小细胞肺癌，与上皮-间充质转变5，6。受体肝细胞生长因子，由 MET 基因，编码是 dysregulatedin 许多肿瘤，据报是重要的一个候选靶向疗法7，8。
战略，以克服 EGFR 测出获得性的耐药正进行临床评价。临床前和临床研究表明，第三代 EGFR 抑制剂如 osimertinib 是 T790M 突变9患者有效。此外，可通过联合治疗 EGFR 和大都会测出6，10抑制 EGFR 突变癌症与大都会放大的增长。评估患者的大都会和 EGFR 抑制剂组合与获得性耐药吉非替尼和埃罗替尼的临床试验正在进行现在是11。
研究对化疗药物产生获得性耐药的分子机制，最初响应抑制剂的细胞系是与这些抑制剂继续治疗。两种方法可用来建立获得性的耐药细胞系。一是逐步的剂量递增，和另一种是接触浓度高。逐步升级方法已被更常用，因为它具有很高的成功率。单元格第一次接触低浓度的抑制剂，近十分之一的半-极大抑制浓度 (IC50) 值，和浓度然后逐渐增加，由 10-30%直到达到靶浓度。高质量浓度暴露法涉及细胞暴露于最后一剂到培养基中，是超过 IC50值，所以几乎彻底杀死亲本细胞抑制剂。此高质量浓度暴露方法具有更低成功率比逐步升级方法。
在以往的研究中，EGFR-使用 tki 药物治疗与 MET-使用 tki 药物治疗联合的治疗被证明是有效的体外系统。获得性的耐药 EFGR-使用 tki 药物治疗，吉非替尼通过逐步升级为 12 个月，MET-放大，成立，因此，吉非替尼耐药细胞线称为 PC 9MET1000 生成的12。
该协议是两步剂量升级程序获得双抗 EGFR-使用 tki 药物治疗，吉非替尼和大都会-使用 tki 药物治疗，PHA665752 的 EGFR 突变的非小细胞肺癌 PC 9 细胞 (图 1)。这种方法建立获得性耐药细胞系中是相对较容易执行，成功率高。描述的协议可以修改为其他分子靶向药物的细胞毒性药物以及抑制剂的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的协议可以用于获得双抗性使用 2 步剂量递增法体外癌细胞中建立。许多研究论文报道，PC-9 细胞抗药性 EGFR-使用 tki 药物治疗 （吉非替尼或厄洛替尼） 通过 T790M EGFR 突变15，16。然而，我们没有检测到 T790M 突变基因外显子 20 的我们的 PC 9MET1000 细胞通过直接测序法 (图 4)。此外，大都会放大观察作为信号转导通路?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢他们提出深思熟虑的意见和有益的建议，分子肿瘤研究所和 Editage 提供的援助与英语语言编辑成员。这项工作是为私立大学 （2012年-2016 年） 从教育部、 文化、 体育、 科学和技术的日本战略研究基金会支持由文部科学省支持程序。钱 Ohmori 收到勃林格殷格翰 （殷格翰，德国） 资金 （2015年-2016 年） 的研究。
Materials
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
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