Che istituisce la doppia resistenza all'EGFR-TKI e incontrato-TKI nel polmone Adenocarcinoma cellule In Vitro con una procedura 2-passo Dose-escalation
Summary
È descritto un metodo in vitro per stabilire doppia resistenza a un EGFR-TKI e un MET-TKI in cellule tumorali. Questo metodo è utile per lo sviluppo di terapie per i pazienti con mutazioni di EGFR, che esibiscono la progressione di malattia malgrado il trattamento di EGFR-TKI con MET-amplificazione. Può anche essere modificato per gli inibitori di altre molecole di targeting.
Abstract
Resistenza ai farmaci è una sfida importante nella terapia del cancro. La generazione di sublines resistente in vitro è necessaria per scoprire nuovi meccanismi per superare questa sfida. Qui, un metodo 2-passo dose-escalation per stabilire dual-resistenza per un recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR)-inibitore tirosin-chinasi (TKI), gefitinib e un MET-TKI, PHA665752, è descritto. Questo metodo si basa sul semplice incremento graduale della dose di inibitori per l’induzione di resistenza in linee cellulari acquisita. Il metodo alternativo per la generazione di resistente sublines consiste nel sottoporre le cellule ad alte concentrazioni dell’inibitore in un unico passaggio. Il metodo di dose-escalation graduale ha una maggiore possibilità di indurre con successo acquisito resistenza rispetto a questo metodo. Attivazione di EGFR mutazioni sono biomarcatori di una risposta al trattamento con EGFR-TKI, che è un trattamento di prima linea applicato per tumori polmonari non a piccole cellule (NSCLC) che ospitano queste mutazioni. Tuttavia, nonostante i rapporti di risposte efficaci, l’uso di EGFR-TKI è limitato perché i tumori inevitabilmente acquisiscono resistenza. I principali meccanismi dietro resistenza EGFR-TKI comprendono una mutazione secondaria presso il sito di gatekeeper, T790M in essone 20 di EGFR e un segnale di bypass di MET. Così, una potenziale soluzione per questo problema sarebbe una combinazione di EGFR-TKI e MET-TKI. Questo trattamento combinato ha dimostrato di essere efficace in un modello di Studio in vitro . Gefitinib-resistenza acquisita è stata stabilita tramite MET-amplificazione di incremento graduale della dose di gefitinib per 12 mesi, e una linea cellulare denominata PC-9MET1000 è stata generata in uno studio precedente. Per indagare ulteriormente i meccanismi di MET-TKI acquisito ed EGFR-TKI resistenza, un MET-TKI, PHA665752, è stato amministrato a queste cellule con incremento graduale della dose in presenza di gefitinib per 12 mesi. Questo protocollo è stato applicato con successo anche per una serie di terapie di combinazione per stabilire la resistenza acquisita ad altre molecole di inibitore.
Introduction
Oncogeniche mutazioni nel recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) sono trovate in un sottogruppo di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e sono importanti biomarcatori predittivi di questa malattia1,2. Questi attivazione delle mutazioni di EGFR più comunemente si verificano come un’omissione in-struttura in essone 19 (delE746-A750) o una mutazione di punto in sostituzione della leucina con arginina a codone 858 dell’esone 21 (L858R) in EGFR tirosin chinasi dominio3,4. Il trattamento con inibitori di EGFR-tirosina chinasi (TKI) è una terapia clinicamente efficace per i pazienti con NSCLC che harboring le mutazioni di EGFR. Tuttavia, questa terapia è limitata dall’inevitabile acquisizione di resistenza all’EGFR-TKI come gefitinib ed erlotinib. La resistenza acquisita più comune si verifica attraverso una mutazione T790M secondaria in essone 20 di EGFR, che è stato rilevato in circa il 60% dei pazienti con EGFR-TKI (gefitinib o erlotinib) resistenza acquisita. Altri meccanismi molecolari associati con resistenza acquisita a EGFR-TKI sono attivazione di bypass segnalazione causato dall’amplificazione di MET, trasformazione di tumori polmonari a piccole cellule e la transizione epiteliale-mesenchimale5,6. Il recettore per il fattore di crescita dell’epatocita, codificato dal gene MET, che è dysregulatedin molti tumori, è stato segnalato per essere un candidato importante per mirate terapie7,8.
Strategie per superare la resistenza acquisita a EGFR-TKI sono ora in fase di valutazione clinica. Studi preclinici e clinici hanno dimostrato che gli inibitori EGFR di terza generazione come osimertinib sono efficaci per i pazienti con la mutazione T790M9. Inoltre, la crescita di tumori EGFR-mutante con MET amplificazione può essere inibita dal trattamento combinato con EGFR e MET TKI6,10. Test clinici che valutano una combinazione di inibitori MET ed EGFR nei pazienti con resistenza acquisita a gefitinib ed erlotinib sono in corso ora11.
Per studiare il meccanismo molecolare della resistenza acquisita agli agenti chemioterapeutici, linee cellulari che inizialmente rispondono agli inibitori sono trattati in continuo con questi inibitori. Due metodi sono disponibili per stabilire la resistenza acquisita in linee cellulari. Uno è incremento graduale della dose, e l’altro è l’esposizione ad alta concentrazione. Il metodo di escalation graduale è stato più comunemente utilizzato, perché ha un più alto tasso di successo. Le cellule sono esposte prima a basse concentrazioni di inibitori, quasi un decimo del valore della concentrazione inibitoria mezzo massima (IC50), e la concentrazione quindi viene gradualmente aumentata del 10-30% fino a quando la concentrazione target è raggiunto. Il metodo di esposizione ad alta concentrazione consiste nel sottoporre le cellule alla dose finale di inibitore nel terreno di coltura, che è maggiore del valore di50 IC, quindi cellule parentali vengono uccisi quasi completamente. Questo metodo di esposizione ad alta concentrazione ha molto un più basso tasso di successo rispetto al metodo graduale escalation.
In uno studio precedente, il trattamento combinato con EGFR-TKI e MET-TKI è stato indicato per essere efficace in un sistema in vitro . Resistenza acquisita ad un EGFR-TKI, gefitinib, è stata stabilita tramite graduale escalation per 12 mesi, insieme a MET-amplificazione, e così, una linea cellulare gefitinib-resistente chiamata PC-9MET1000 è stato generato12.
Il protocollo qui presentato è una procedura di dose-escalation in due fasi per ottenere cellule di NSCLC EGFR-mutato del PC-9 con doppia resistenza all’EGFR-TKI, gefitinib e un MET-TKI, PHA665752 (Figura 1). Questo metodo per stabilire acquisito resistente in linee cellulari è relativamente facile da effettuare, con un alto tasso di successo. Il protocollo descritto può essere modificato per applicazione con inibitori di altri farmaci a bersaglio molecolare e agenti citotossici pure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui può essere utilizzato per la creazione di dual-resistenza acquisita in cellule di cancro usando una dose crescente 2-passo metodo in vitro. Molti documenti di ricerca hanno segnalato che le cellule PC-9 sviluppato EGFR-TKI (gefitinib o erlotinib) resistenza attraverso mutazioni EGFR T790M15,16. Tuttavia, non abbiamo rilevato le mutazioni T790M in essone 20 delle nostre cellule PC-9MET1000 mediante sequenziamento diretto (<str…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri dell’Istituto di oncologia molecolare per i loro commenti riflessivo e consigli utili ed Editage per la loro assistenza con la modifica di lingua inglese. Questo lavoro è stato supportato dal programma MEXT-supportato per la Fondazione di ricerca strategica alle università Private (2012-2016) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone. Tohru Ohmori ricevuto (2015-2016) di finanziamento della ricerca da Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Germania).
Materials
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
Riferimenti
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