JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Medicina

In Vivo Billeddannelse af Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL Reporter mus med røde-domæne optisk kohærens tomografi og Scanning Laser oftalmoskopi

Published: November 11, 2017
doi:
10.3791/55984
, , ,
1Department of Ophthalmology and Department of Clinical Research,Bern University Hospital and University of Bern

Summary

Denne protokol beskriver hvordan høj opløsning Billeddannende teknikker såsom spektrale domæne optisk kohærens tomografi og scanning laser oftalmoskopi kan udnyttes i små gnavere, ved hjælp af en oftalmologiske billedbehandlingssystem for platform, for at indhente oplysninger om retinal tykkelse og microglial celle distribution, henholdsvis.

Abstract

Spektrale domæne optisk kohærens tomografi (SD-OCT) og scanning laser oftalmoskopi (SLO) er flittigt brugt i eksperimentel oftalmologi. I denne protokol, mus udtrykker grøn fluorescerende proteiner (NGL) promotor af Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1normal god landbrugspraksis/normal god landbrugspraksis) blev brugt til at afbilde mikroglia celler i vivo i nethinden. Mikroglia er bosiddende makrofager af nethinden og har været impliceret i flere retinal sygdomme1,2,3,4,5,6. Denne protokol giver en detaljeret metode til generering af retinale B-scanninger, med SD-OCT og billeddannelse af mikroglia celle distribution i Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL mus med SLO i vivo, ved hjælp af en oftalmologiske billedbehandlingssystem for platform. Protokollen kan bruges i flere reporter mus linjer. Der er dog nogle begrænsninger i protokollen præsenteres her. Først, både SLO og SD-OLT, når det bruges i tilstanden høj opløsning indsamle data med høj aksial opløsning, men den laterale opløsning er lavere (3,5 µm og 6 µm, henholdsvis). Desuden, fokus og mætning niveau i SLO er stærkt afhængigt af parameteren udvælgelse og korrekt justering af øjet. Derudover bruger udstyr designet til menneskelige patienter i mus er udfordrende på grund af den højere samlede optiske effekt af musen øjet i forhold til det menneskelige øje; Dette kan føre til lateral forstørrelse unøjagtigheder7, som er også afhængige af forstørrelse af musen linsen bl.a. Men på trods af at den aksial scanning holdning er afhængig af laterale forstørrelse, aksial SD-okt målingerne er præcise8.

Introduction

Undersøgelse af retinale patologi vurderes i eksperimentel oftalmologi, normalt ved hjælp af histologiske teknikker. Men histologi kræver dyre euthanization og kan medføre ændring af de faktiske egenskaber af væv. SD-OCT og SLO anvendes rutinemæssigt i klinisk oftalmologi til diagnostiske formål og til overvågning af flere retinal sygdomme såsom diabetisk makulaødem9, forreste iskæmisk optisk neuropati10eller retinitis pigmentosa11 . SD-OCT og SLO er non-invasiv teknik, der genererer høj opløsning billeder af nethinden, der er visualiseret gennem det forstørrede elev uden yderligere indgriben. SD-okt indeholder oplysninger af retinale struktur og retinal tykkelse ved at indsamle backscattering data for at oprette tværsnit billeder af nethinden, mens SLO indsamler fluorescens data til at producere stereoskopiske billeder med høj kontrast af nethinden. I dag er begge teknikker bruges i stigende grad i eksperimentel oftalmologi ved hjælp af små gnavere12,13,14,15 (eller endda zebrafisk16,17) og kan give både kvalitative og kvantitative oplysninger12,17,18,19,20,21.

Ophobning af endogene fluorophores som lipofuscins eller dannelsen af drusen i nethinden kan visualiseres ved SLO som auto fluorescerende signal. Denne funktion gør SLO en værdifuld teknik til diagnose og overvågning af retinale sygdomme, såsom aldersrelateret makuladegeneration eller retinitis pigmentosa22,23. I eksperimentelle oftalmologi, kan auto fluorescens imaging (AF) anvendes til påvisning af specifikke celletyper i reporter mus linjer. F.eks er mus heterozygous for udtryk for normal god landbrugspraksis promotor af Cx3cr124 fordelagtige for i vivo visualisering af microglial celler i den normale nethinden og for undersøgelse af mikroglia/makrofag Dynamics i retinal sygdom21. Mikroglia er de bosiddende makrofager af nethinden, der spiller en afgørende rolle på væv homøostase og væv reparation efter skade1,25,26. Mikroglia aktivering i nethinden er blevet rapporteret i retinal skade, iskæmi og degeneration, tyder på en rolle for disse celler i retinal sygdom2,3,4,5, 6.

Formålet med denne protokol er at beskrive en relativt enkel metode for nethinde billedbehandling og måling af retinale tykkelse ved hjælp af SD-okt, og visualisering af normal god landbrugspraksis positive mikroglia celler i Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL mus nethinden bruger SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT system). Denne protokol kan udnyttes til billedbehandling og tykkelse målinger af sunde eller syge nethinder i forskellige mus linjer. Derudover kan morfometrisk analyser udføres for identifikation og kvantificering af mikroglia numre og mikroglia aktivering i nethinden ved hjælp af SLO21. Mikroglia celler er associeret med degenerative sygdomme i centralnervesystemet (CNS), herunder nethinden27,28,29. Således, ved at kombinere de to metoder, der anvendes i denne protokol, korrelation af mikroglia distribution og retinal degeneration kan gøres, som kan lette overvågning sygdommens sværhedsgrad eller effektiviteten af terapeutiske tilgange i vivo.

Protocol

i alle procedurer, BALB/c voksne mandlige og kvindelige mus som udtryk for normal god landbrugspraksis promotor af Cx3cr1 blev brugt 24. Mus blev behandlet ifølge ARVO erklæring om brug af dyr i Ophthalmic og Vision forskning og alle procedurer blev godkendt fra den schweiziske regering Federal schweiziske forordninger om dyrevelfærd. Mus var bedøvede af en subkutan injektion af medetomidine hydrochlorid (0,75 mg/kg) og ketamin (45 mg/kg). Ordentlig anæstesi blev bekræftet ved at …

Representative Results

Ved hjælp af protokollen præsenteres her, SD-okt scanner og SLO billeder blev fremstillet af Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL mus i samme imaging-session. Figur 3 omfatter repræsentant SD-OCT enkelt scanninger opnås med en 30 ° eller en 55 ° linse (figur 3A) og repræsentative SLO billeder opnås med en 55 ° eller en 102 ° linse, hvor normal god landbrugspraksis positive mikroglia celler er visua…

Discussion

Denne artikel viser en protokol for erhvervelse af retinale B-scanninger og billedbehandling af normal god landbrugspraksis positive mikroglia distribution i mus nethinden i samme imaging-session. SD-OCT og SLO bruges i stigende grad i dyremodeller af retinal sygdom for at give oplysninger af retinale forandringer over tid10,14,17,18,21. Med denne protokol, <e…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af en bevilling af den schweiziske National Science Foundation (SNSF, #320030_156019). Forfatterne fik støtte fra Heidelberg Engineering GmBH, Tyskland.

Materials

Spectralis Imaging system (HRA+OCT) Heidelberg Engineering, Germany N/A ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Germany N/A Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens Volk Optical Inc., Ohio, USA V78C
Spectralis wide angle 55° lens Heidelberg Engineering, Germany 50897-002
ultra widefield 102° lens Heidelberg Engineering, Germany 50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) Provet AG, Lyssach, Switzerland Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar) Parke-Davis, Zurich, Switzerland 72276388 anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) ISPI, Bern, Switzerland N/A pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany 9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) OmniVision, Neuhausen, Switzerland N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY N/A Base Curve: 7.20 to 8.40 mm
Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm
Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS) Inselspital, Bern, Switzerland N/A
silicon forceps N/A N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) Provet AG, Lyssach, Switzerland N/A α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7 GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA N/A statistical analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
  2. Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
  3. Langmann, T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).
  4. Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
  5. Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
  6. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
  7. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  8. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  9. Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
  10. Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
  11. Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
  12. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  13. Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
  14. Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
  15. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
  16. Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
  17. Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
  18. Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
  19. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
  20. Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
  21. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
  22. Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
  23. Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
  26. Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
  27. Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
  28. Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
  29. Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
  30. Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
  31. Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
  32. Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
  33. Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
  34. Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
  35. Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
  36. Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
  37. Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
  38. Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).

Tags

In Vivo ImagingCx3cr1gfp/gfp Reporter MiceSpectral-domain Optical Coherence TomographyScanning Laser OphthalmoscopyRetinal ThicknessMicroglial Cell DistributionNon-invasiveCorneal Contact LensInfrared ImagingAutofluorescence Imaging
check_url/it/55984?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy. J. Vis. Exp. (129), e55984, doi:10.3791/55984 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image