Kondrogen pelletsdannelse fra Cord Blood-avledede Induced Pluripotent Stamceller

Summary

Her foreslår vi en protokoll for kondrogen differensiering fra blodblodmononukleærcelle-avledede, menneskeskapte pluripotente stamceller.

Abstract

Menneskelig leddbrusk mangler evnen til å reparere seg selv. Bruskdegenerasjon behandles således ikke ved kurativ, men ved konservative behandlinger. For tiden er det gjort anstrengelser for å regenerere ødelagt brusk med eks vivo utvidede kondrocytter eller benmarg-avledede mesenkymale stamceller (BMSCs). Den begrensede levedyktighet og ustabilitet av disse cellene begrenser imidlertid deres anvendelse i bruskutbygging. Menneskeinducerte pluripotente stamceller (hiPSCs) har fått vitenskapelig oppmerksomhet som et nytt alternativ for regenerative applikasjoner. Med ubegrenset selvfornyelsesevne og multipotency har hiPSCs blitt uthevet som en ny erstatningscellekilde for brusk reparasjon. Imidlertid er det en stor utfordring for deres kliniske anvendelse å skaffe en høy mengde chondrogenpellets av høy kvalitet. I denne studien brukte vi embryoidlegemer (EB) -avlede utvoksningsceller for kondrogen differensiering. Vellykket kondrogenese ble bekreftet av PCR anD-farvning med alcianblått, toluidinblått og antistoffer mot henholdsvis kollagentyper I og II (henholdsvis COL1A1 og COL2A1). Vi gir en detaljert metode for differensiering av blodmononukleære celle-avledede iPSCs (CBMC-hiPSCs) i kondrogenpellets.

Introduction

Bruken av hiPSCs representerer en ny strategi for narkotika-screening og mekanistiske studier av ulike sykdommer. Fra et regenerativt perspektiv er hiPSCer også en potensiell kilde for erstatning av skadede vev som har begrenset helbredelsesevne ^, som leddbrusk ^{1 , 2} .

Regenerering av innfødt leddbrusk har vært en utfordring i flere tiår. Articular brusk er et mykt, hvitt vev som belegger enden av bein, beskytter dem mot friksjon. Imidlertid har den begrenset regenerativ evne når den er skadet, noe som gjør selvreparasjon nesten umulig. Derfor har forskning fokusert på bruskregenerering vært igangsatt i flere tiår.

Tidligere ble in vitro differensiering i kondrogene linjer vanligvis utført med BMSC'er eller native kondrocytter isolert fra knæleddet ³ . DuettO deres kondrogen potensial, BMSC og nasjonale kondrocytter har mange fordeler som støtter deres bruk i kondrogenese. På grunn av deres begrensede ekspansjon og ustabile fenotype står imidlertid disse cellene overfor flere begrensninger i rekonstruksjonen av leddbruskdefekter. Under in vitro kulturbetingelser har disse cellene en tendens til å miste sine egne egenskaper etter 3-4 passasjer, noe som til slutt påvirker deres differensieringsevner ⁴ . Også i tilfelle av nasjonale kondrocytter er ytterligere skade på kneleddet uunngåelig ved oppnåelse av disse cellene.

I motsetning til BMSCs eller native kondrocytter, kan hiPSCs utvide ubestemt in vitro . Med de rette kulturbetingelsene har hiPSCs stort potensial som en erstatningskilde for kondrogen differensiering. Imidlertid er det utfordrende å endre hjerteegenskapene til hiPSCs ⁵ . Videre tar det flere kompliserte in vitro stePs å lede skjebnen til hiPSCs til en bestemt celletype. Til tross for disse komplikasjonene anbefales bruk av hiPSCs fortsatt på grunn av deres høye selvfornyelsesevner og deres evne til å skille seg inn i målrettede celler, inkludert kondrocyter ⁶ .

Kondrogen differensiering gjøres vanligvis med tredimensjonale kultursystemer, slik som pelletkulturen eller mikromasskulturen, ved bruk av MSC-lignende stamceller. Hvis du bruker hiPSCs, er protokollen for å generere MSC-lignende stamceller forskjellig fra de eksisterende protokollene. Noen grupper bruker monolagskultur av hiPSCs for direkte å konvertere fenotypen til MSC-lignende celler ⁷ . Imidlertid bruker de fleste studier EBs til å generere vekstceller som ligner MSCs ^{8 , 9 , 10 , 11} .

Ulike typer vekstfaktorer brukes til å indusere kondomNesis. Vanligvis brukes BMP- og TGFβ-familieproteiner, alene eller i kombinasjon. Differensiering har også blitt indusert med andre faktorer, slik som GDF5, FGF2 og IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} . TGFβ1 har vist seg å stimulere kondrogenese på en doseavhengig måte i MSCs ¹⁶ . Sammenlignet med den andre isotypen, TGFβ3, inducerer TGFβ1 kondrogenese ved å øke pre-brusk mesenkymcellekondensasjon. TGFβ3 inducerer kondrogenese ved betydelig økning av mesenkymcelleproliferasjonen ¹⁷ . Imidlertid brukes TGFβ3 oftere av forskere enn TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} . BMP2 øker ekspresjonen av gener relatert til kondrogen-matriks-komponentene i menneskerArtikulære kondrocytter under in vitro betingelser ²⁰ . BMP2 øker ekspresjonen av gener som er kritiske for bruskdannelse i MSCs i kombinasjon med TGFβ-proteiner ²¹ . Det har også blitt vist at BMP2 synergistisk forbedrer effekten av TGFβ3 gjennom Smad og MAPK-veiene ²² .

I denne studien ble CBMC-hiPSCs aggregert i EB'er ved bruk av EB-medium i en petriskål med lav vedlegg. Utvekstceller ble indusert ved å feste EBsene til en gelatine-belagt parabolen. Kondrogen differensiering ved bruk av utvekstceller ble utført ved pelletkultur. Behandling med både BMP2 og TGFβ3 kondenserte vellykket cellene og indusert ekstracellulær matriks (ECM) proteinakkumulering for kondrogen pelletsdannelse. Denne studien antyder en enkel, men effektiv kronondrogen differensieringsprotokoll ved bruk av CBMC-hiPSCs.

Protocol

Denne protokollen ble godkjent av det institusjonelle gjennomgangskortet til det katolske universitetet i Korea (KC12TISI0861). CBMCs som ble brukt til omprogrammering, ble direkte hentet fra Cord Blood Bank i Seoul St. Marys Hospital. 1. Kondrogen Differensiering fra iPSCs CBMC-iPSC generasjon Generer CBMC-hiPSCs ved hjelp av protokollen vist i vårt tidligere arbeid 23 . Samle blodcellene i et 15 ml konisk rør og telle…

Representative Results

I denne studien genererte vi kondrogenpellets fra CBMC-hiPSCs ved å indusere utvekstceller fra EBs. Kondrogene differensier ble indusert ved bruk av CBMC-hiPSCs med bekreftet høy pluripotens 11 . En enkel ordning av protokollen vår er vist i figur 1A . Før differensiering ble iPSC-kolonier utvidet ( figur 1B ). De utvidede iPSCene ble samlet som EBs for å initiere differensiering ( <strong class="xfi…

Discussion

Denne protokollen har generert hiPSCer fra CBMCs. Vi reprogrammerte CBMCs til hiPSCs ved hjelp av en Sendai viral vektor som inneholder Yamanaka-faktorene ²⁴ . Tre tilfeller ble brukt i differensiering, og alle eksperimenter genererte vellykket kondrogenpellets ved hjelp av denne protokollen. Mange studier har rapportert protokoller for differensiering av hiPSCs i kondrocyter ^{25 , 26 , 27 ,} <s…

Materials

Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
Name	Company	Catalog Number	Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Catalog Number	Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
xylene	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's hematoxylin solution	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Catalog Number	Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM	Life Technologies	11885	Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R&D	355-BM-050	Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3	R&D	243-B3-002	Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Sodium pyruvate solution	Sigma Aldrich	S8636	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
L-Proline	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogenic media component (40μg/ml)