تأتي إلى "جانب الضوء": "في فيفو" الرصد الزائفة الزّنجاريّة بيوفيلم الالتهابات في "الجروح المزمنة" في "نموذج مورين أصلع السكري"
Summary
هنا يصف لنا نموذجا مورين السكري رواية استخدام الفئران أصلع للرصد في الوقت الحقيقي، وغير الغازية، من عدوى الجرح بيوفيلم من طرحه الزائفة الزّنجاريّة. هذا الأسلوب يمكن تكييفها لتقييم العدوى الأخرى أنواع البكتيريا والكائنات الدقيقة المحورة وراثيا، بما في ذلك الأغشية الحيوية المتعددة الأنواع، واختبار فعالية استراتيجيات أنتيبيوفيلم.
Abstract
ويعتقد وجود البكتيريا كمنظم الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة، خصوصا في مرضى السكري، للحيلولة دون التئام الجروح والقرار. قد استخدمت نماذج الجروح المزمنة الماوس فهم التفاعلات الأساسية بين الكائنات الحية الدقيقة والبلد المضيف. النماذج التي وضعت حتى الآن تعتمد على استخدام الحيوانات الشعر وجمع المحطة الطرفية من أنسجة الجرح لتحديد البكتيريا قادرة على البقاء. في حين قد اكتسبت فكرة كبيرة مع هذه النماذج، يتطلب هذا الإجراء التجريبي عدد كبير من الحيوانات وأخذ العينات مضيعة للوقت. وقد وضعنا نموذجا رواية مورين الذي يشتمل على العديد من الابتكارات الأمثل لتقييم التقدم بيوفيلم في الجروح المزمنة:) فإنه يستخدم الفئران أصلع، مما يلغي الحاجة لإزالة الشعر؛ ب) ينطبق قبل تشكيل الأغشية الحيوية للجروح تسمح بتقييم فوري لاستمرار وتأثير هذه الجاليات على المضيف؛ ج) ترصد تطور بيوفيلم بالتحديد الكمي لإنتاج الضوء من سلالة طرحه المهندسة وراثيا من الزائفة الزّنجاريّة، يسمح للرصد في الوقت الحقيقي للعدوى وبالتالي تقليل عدد الحيوانات اللازمة للدراسة. في هذا النموذج، أنتجت في الجزء الخلفي الفئران أصلع السكري الناجم عن STZ جرح عمق كامل واحد وتلقيح مع الأغشية الحيوية لسلالة P. الزّنجاريّة طرحه 41 كسين. الضوء الناتج من الجروح تسجل يوميا في في فيفو نظام التصوير، بما يسمح للتصور بيوفيلم السريع في فيفو و في الموقع وتوطين البكتيريا بيوفيلم داخل الجروح. يعد هذا الأسلوب رواية مرنة كما يمكن استخدامها لدراسة الكائنات المجهرية الأخرى، بما في ذلك الأنواع المحورة وراثيا، والأنواع المتعددة من الأغشية الحيوية، وقد تكون ذات قيمة خاصة في اختبار استراتيجيات مكافحة بيوفيلم بما في ذلك مضادات الميكروبات الضمادات الانسداد.
Introduction
الأغشية الحيوية هي مجتمعات معقدة من الكائنات الحية الدقيقة جزءا لا يتجزأ من مصفوفة مواد البوليمرية التي تم إبرازها عاملاً مساهما للقرار الفقراء من الجروح المزمنة1. دراسة هؤلاء السكان الميكروبية عالية التنظيم، واستمرار أهمية خاصة لمرضى السكري حيث يؤدي ضعف الدورة الدموية على أطرافه وتغيير الآليات الحسية الطرفية للآفات التي لم يتم كشفها2. في الولايات المتحدة، ويقدر أن 15% مرضى السكري بوضع قرحة واحدة على الأقل أثناء حياتهم. وهذا يترجم إلى نفقات اقتصادية بحوالي 28 بیلیون دولار في المعاملة3،4، ناهيك عن العبء العاطفي والاجتماعي إيمينسورابل. فهم العوامل التي تسمح للمجتمعات الميكروبية على المثابرة في قاع الجرح والأثر الذي تحدثه هذه الأغشية الحيوية في أحداث الشفاء لا بد من محرك تحسين الرعاية للمرضى المتضررين ودفع تطوير نهج معاملة جديدة. ولذلك، إنشاء نماذج قابل للنقل واستنساخه في فيفو لاستكشاف التفاعلات البكتيرية-المضيف أمر بالغ الأهمية.
-تم تطوير نماذج مورين بنجاح لدراسة تأثير الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة. هذه النماذج، ومع ذلك، غالباً ما الاستفادة من أنواع الشعر وتقييم إزالة بيوفيلم بتهم لوحة للخلايا البكتيرية قابلة للاستمرار من الأنسجة قصت من الحيوانات التضحية، يجعلها تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة.
كان أول من اقترح بديلاً بيوفوتونيك لأخذ عينات من الحيوانات في تقييم الإصابة نقطة نهاية كونتاج وآخرون. (1995) 5 ، الذين وضعت طريقة لالتقاط التﻷلؤ من طرحه مؤثرا typhimurium السالمونيلا لقياس مدى فعالية العلاج بالمضادات الحيوية. اتبعت الدراسات الأخرى الاستفادة من البكتيريا التي تنبعث منها الإضاءة الحيوية. على سبيل المثال، روشيتا وآخرون. (2001) 6 التحقق من صحة نموذج عدوى لدراسة الإشريكيّة القولونية الفخذ العدوى في الفئران عن طريق قياس التﻷلؤ باستخدام جهاز اقتران مكثفة وفي وقت لاحق، كادوروجامووا وآخرون. (2003) 7 استغل فوتون انبعاث خصائص عبئا هندسيا ل المكوّرات العنقودية الذهبية للتحقيق في مدى فعالية المضادات الحيوية عدة في نموذج جرح قسطرة في الفئران.
ويعرض الأسلوب يتميز هنا بروتوكولا مباشرة للحث على مرض السكري في الفئران أصلع وإنتاج وتطعيم الجروح مع الأغشية الحيوية طرحه قبل المشكلة من P. الزّنجاريّة، والقيام بعمليات رصد بيوفوتونيك العدوى باستخدام في فيفو نظام التصوير. ويوفر المباشر، السريع، في عين المكان، والعملية غير الغازية والكمي لتقييم الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة وعلاوة على ذلك، يسمح للتحليل إضافية مثل التصوير المجهري لشفاء الجروح، جمع الدم المتقطع سيتوكين القياسات، وجمع الأنسجة الطرفية لعلم الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يصف لنا نموذج ماوس جديد لدراسة الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة السكري يحتوي على العديد من المزايا لإنشاء نموذج استنساخه، والترجمة، ومرنة.
الابتكار الأول هو استخدام الفئران أصلع. -تم تطوير نماذج الماوس الأخرى لدراسة السكري الجرح المزمن شفاء10،<sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر “جمعية السكري الأمريكية” لدعم هذا العمل (منحة # #7-13-بكالوريوس-180)، “ميشيغان الدولة جامعة بحوث التكنولوجيا دعم المرفق” لتوفير التدريب والوصول إلى في فيفو نظام التصوير ميشيغان الدولة جامعة التحقيق الأنسجة معمل لتجهيز خزعات الماوس لدراسة نسيجية.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
Riferimenti
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
