Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino
Summary
Aquí describimos un nuevo modelo murino diabético utilizando ratones sin pelo en tiempo real, no invasivo, vigilancia de infecciones de la herida del biofilm de bioluminiscente Pseudomonas aeruginosa. Este método puede adaptarse para evaluar infección de otras especies de bacterias y microorganismos modificados genéticamente, como los biofilms multiespecies y comprobar la eficacia de estrategias antibiofilm.
Abstract
La presencia de bacterias como biofilms estructurados en heridas crónicas, especialmente en pacientes diabéticos, se piensa para prevenir la cicatrización y resolución. Modelos de heridas crónicas de ratón se han utilizado para entender las interacciones subyacentes entre los microorganismos y el huésped. Los modelos desarrollados hasta la fecha se basan en el uso de animales de pelo y terminal colección de tejido de la herida para la determinación de bacterias viables. Mientras que el conocimiento significativo se ha ganado con estos modelos, este procedimiento experimental requiere un gran número de animales y muestreo es desperdiciador de tiempo. Hemos desarrollado un nuevo modelo murino que incorpora varias innovaciones óptima para evaluar progresión de biofilm en heridas crónicas: un) utiliza ratones sin pelo, eliminando la necesidad de depilación; b) biopelículas preformadas se aplica a las heridas, lo que permite la evaluación inmediata de la persistencia y efecto de estas comunidades en host; c) vigila evolución biofilm mediante la cuantificación de producción de luz por una cepa bioluminiscente mediante ingeniería genética de Pseudomonas aeruginosa, que permite el monitoreo en tiempo real de la infección, reduciendo así el número de animales requeridos por el estudio. En este modelo, una sola herida de toda profundidad se produce en la espalda de ratones sin pelo diabetes inducida por STZ e inoculada con biopelículas de la cepa bioluminiscente de p. aeruginosa 41 de Xen. Salida de luz de las heridas se registra diariamente en un en vivo sistema de imagen, permitiendo una visualización rápida de biofilm en vivo y en situ y localización de biofilm de bacterias en las heridas. Este novedoso método es flexible ya que puede ser utilizado para el estudio de otros microorganismos, incluyendo especies genéticamente y biofilms multiespecies y puede ser de especial valor en la prueba anti-biofilm estrategias incluyendo antimicrobianos vendajes oclusivos.
Introduction
Los biofilms son comunidades complejas de microorganismos embebidos en una matriz de sustancias poliméricas que se han destacado como un factor que contribuye a la resolución pobre de heridas crónicas1. El estudio de estas poblaciones microbianas altamente organizadas y persistente es particularmente importante para los pacientes diabéticos, donde la mala circulación en las extremidades y alteración mecanismos sensoriales periféricos conducen a lesiones no detectadas2. En los Estados Unidos, se estima que 15% de los pacientes diabéticos desarrollará al menos una úlcera durante el curso de sus vidas. Esto se traduce en un gasto económico de cerca de 28 billones de dólares en tratamiento3,4, por no mencionar la carga emocional y social inconmensurable. Comprender los factores que permiten a las comunidades microbianas a persistir en el lecho de la herida y el impacto de estos biofilms en los eventos de sanación es imprescindible para la mejor atención para los pacientes afectados e impulsar el desarrollo de nuevos enfoques de tratamiento. Por lo tanto, es primordial el establecimiento de modelos reproducibles y traducible en vivo para explorar las interacciones bacterianas-host.
Modelos murinos se han desarrollado con éxito para estudiar el impacto de los biofilms en heridas crónicas. Estos modelos, sin embargo, a menudo utilizan especies con pelos y evaluación el despacho de biofilm por cantidad placa de células bacterianas viables del tejido suprimido de animales sacrificados, haciéndolos lentos y costosos.
Una alternativa de la biofotónica para el muestreo de punto final de los animales en la evaluación de la infección primero fue propuesta por Contag et al. (1995) 5 , que desarrolló un método para capturar de la luminescencia de constitutivamente bioluminiscente Salmonella typhimurium para medir la eficacia del tratamiento antibiótico. Otros estudios aprovechando las bacterias emiten bioluminiscencia seguido. Por ejemplo, Rochetta et al. (2001) 6 validado un modelo de infección para estudiar infecciones de muslo de Escherichia coli en ratones mediante la medición de luminiscencia con un intensificado dispositivo acoplado de carga y posteriormente, Kadurugamuwa et al. (2003) 7 tomó ventaja del fotón emisión de propiedades de una ingeniería cepa de Staphylococcus aureus para investigar la eficacia de varios antibióticos en un modelo de catéter herida en ratones.
El método caracterizado aquí presenta un protocolo sencillo para inducir diabetes en ratones sin pelo, producir y sembrar las heridas con formadas biofilms bioluminiscentes de p. aeruginosa y biofotónica control de la infección usando un en vivo sistema de imagen. Ofrece un directo, rápido, en situ, proceso cuantitativo y no invasiva para evaluar biofilms en heridas crónicas y además, permite el análisis adicional tales como la proyección de imagen microscópica de curación de la heridas, colección de sangre intermitente para las mediciones del cytokine y colección de tejido terminal para histología.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un nuevo modelo de ratón para el estudio de biofilms en las heridas crónicas diabéticos que tiene muchas ventajas para crear un modelo flexible, reproducible y traducible.
La primera innovación es el uso de ratones sin pelo. Se han desarrollado otros modelos de ratón para el estudio de heridas crónicas diabéticos10,11, pero todos se han basado en el uso de ratones de pelo que requieren la eliminación de la pie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Asociación Americana de Diabetes para apoyar este trabajo (Grant # #7-13-BS-180), la Michigan estado Universidad tecnología de apoyo Centro de investigación para proporcionar capacitación y acceso al en vivo sistema de imagen y la Michigan estado Universidad investigación histopatología laboratorio para el procesamiento de las biopsias de ratón para la examinación histopatológica.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
Riferimenti
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