نموذج خلية ثقافة مقاومة الشرايين
Summary
ويرد نموذج ثقافة خلية مقاومة الشرايين، السماح بالتشريح لإشارات المسارات في البطانة، العضلات الملساء، أو بين البطانة والعضلات الملساء (ملتقى ميوندوثيليال). التطبيق الانتقائي ليضع أو عزل البروتين أو المجهر الإلكتروني الفلورة يمكن الاستفادة من استخدام هذا النموذج ثقافة الخلية.
Abstract
تقاطع ميوندوثيليال (ميج)، ميكرودومين مما يشير إلى فريدة من نوعها في القطر الصغير مقاومة الشرايين، يسلك التعريب من البروتينات المحددة وعمليات إرسال الإشارات التي يمكن التحكم في لهجة الأوعية الدموية وضغط الدم. كما هو إسقاط أما من الخلية البطانية أو العضلات الملساء، وسبب الصغيرة الحجم (في المتوسط، منطقة ~ 1 ميكرومتر2)، ميج من الصعب على الدراسة في عزلة. ومع ذلك، قمنا بتطوير نموذج ثقافة خلية تسمى الخلية الأوعية الدموية ثقافة المشارك (فككك) الذي يسمح في المختبر تشكيل ميج واستقطاب الخلية البطانية وتشريح لإشارات البروتينات والعمليات في جدار الأوعية الدموية للمقاومة الشرايين. فككك لديها العديد من التطبيقات، ويمكن تكييفها لتناسب أنواع مختلفة من الخلايا. النموذج يتكون من نوعين من الخلايا المزروعة على طرفي نقيض من عامل تصفية مع 0.4 ميكرومتر المسام فيها في المختبر ميس يمكن أن تشكل. هنا ونحن تصف كيفية إنشاء فككك عبر طلاء الخلايا وعزله بطانية، ميج، والكسور العضلات الملساء، التي يمكن استخدامها لعزل البروتين أو النشاط ثم فحوصات. يمكن أن تكون ثابتة عامل التصفية مع طبقات الخلية سليمة، جزءا لا يتجزأ، ومقطعة لتحليل إيممونوفلوريسسينت. الأهم من ذلك، العديد من الاكتشافات من هذا الطراز تم التأكد من استخدام الشرايين المقاومة سليمة، مما يؤكد أهميتها الفسيولوجية.
Introduction
في الشرايين مقاومة صغيرة القطر، يفصل الصفيحة مرنة داخلية رقيقة (IEL) بطانية (EC) وخلايا العضلات الملساء (SMC). الخلايا يمكن المشروع من خلال الثقوب في هذه المصفوفة مطاطا وإجراء اتصالات هيولى مباشرة عبر الفجوة تقاطع القنوات1،2. ويطلق على هذا الهيكل الفريد مفرق ميوندوثيليال (مج). ميج صغيرة (حوالي 0.5 ميكرون × 0.5 ميكرومتر، اعتماداً على السرير والأوعية الدموية) والإسقاط الخلوية مكونة أساسا من خلايا بطانية ولكن قد تنشأ من العضلات الملساء، فضلا عن3،4. وقد تظاهر عدد من المحققين تعقيدات هائلة مما يشير إلى الشبكات التي تحدث بشكل انتقائي في ميج، مما يجعله في موقع أهمية خاصة لتيسير إشارات ثنائية الاتجاه بين البطانة والعضلات الملساء5 ،،من67،،من89،10.
ومع ذلك، تشريح ميكانيكية من مسارات الإشارات في ميج أمر صعب في شريان سليمة. نظراً ميج إسقاطاً خلوية، من غير الممكن حاليا لعزل في فيفو ميج من جدار الأوعية الدموية. ولهذا السبب، تم تطوير نموذج فككك1 . الأهم من ذلك، فككك يتطابق مورفولوجيا غشائي الفسيولوجية11 واستقطاب الإشارات بين قمي وأجزاء ميج الخلية12. كان هذا النموذج الفريد التي تسهل اكتشاف أن الهيموغلوبين ألفا في الخلية بطانية، الاستقطاب إلى ميج. هذا على النقيض من خلايا بطانية المستزرعة تقليديا التي لا تعبر عن الهيموغلوبين ألفا13. للباحثين المهتمين في البطانة ميكروفاسكولار، قد يكون من الأنسب استخدام الخلايا البطانية التي قد تم مثقف في فككك، خاصة إذا كان القصد هو تشريح مسارات الإشارات التي تحدث في الشرايين مقاومة صغيرة القطر.
استخدام قوي إدراج بلاستيكية تحتوي على عامل تصفية مع مسام صغيرة القطر (0.4 ميكرومتر في القطر) لأنواع الخلايا المتميزة ثقافة المشارك الثاني يمنع الخلايا من الهجرة بين الطبقات. أنه يؤدي إلى مسافة 10 ميكرون بين الخلايا، والتي هي أطول بكثير في فيفو، ولكن لا يزال يتطابق العديد من الخصائص في فيفو ميس، بما في ذلك الترجمة البروتين ورسول الثاني يشير إلى1 , 14-وبالإضافة إلى ذلك، يسمح فككك لاستهداف الخلية إشارات عن طريق إضافة مؤثر أو خصم لحجرة الهاتف الخلوي محددة خاصة بنوع. على سبيل المثال، تحميل الجماعة الأوروبية مع باتا-صباحا يخلب الكالسيوم، وحفز SMC مع فينيليفريني14. وعلى النقيض من الأوصاف الأخرى من ثقافة المشارك15،نماذج16،18،17،19،،من2021، وهذا يوفر تعليمات بشأن عزل الكسور متميزة مرناً والبروتين، بما في ذلك الكسر مج متميزة داخل المسام عامل التصفية. الإضافة لهذه التقنية فككك يسمح للتحقيق محددة من التغييرات في التعريب مرناً أو النسخ22والبروتين الفسفرة12،23و نشاط البروتين12. هذه المادة سوف تصف الطلاء من الجماعة الأوروبية على رأس عامل التصفية و SMC في الجزء السفلي، على الرغم من أن من الممكن أن الثقافة أنواع الخلايا اثنين في والتشكلات المختلفة11،،من1824.
Protocol
Representative Results
Discussion
فككك يحتوي على عدد من المزايا من حيث حظيا ميس في المختبر، ولكن هناك نقاط المناقشة عند تحديد إذا فككك يمكن أن تستخدم لتطبيق معين. على سبيل المثال، إذا كانت أنواع مختلفة من الخلايا لاستخدامها مع هذا النموذج، سوف تحتاج إلى الأمثل. وقد استخدمنا خلايا الإنسان الأولية، لكن من الممكن عزل الخ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده هذا العمل “الوطني للقلب”، الرئة والدم المعهد منح 14PRE20420024 زمالة بريدوكتورال R01088554، T32HL007284، وجمعية القلب الأمريكية. ونشكر خصوصا “سانت جود الخلوية التصوير المشتركة البحوث الأساسية”، بما في ذلك ويكفيلد راندال وهورنر ليندا لصور المجهر الإلكتروني، وآدم ستراوب للمساعدة مع الصور الفلورة الممثل واغر Pooneh لها تعليقات قيمة على البروتوكول المخطوطة.
Materials
| 24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225cm2 flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
Riferimenti
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
- Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix?. Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
- Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
- Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
- Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
- Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
- Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
- Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
- Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
- Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
- Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
- Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
- Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
- Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
- Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
- Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
- Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
- Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
- Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
- Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).
