आंसू Cytokine प्रोफाइल के विश्लेषण के लिए मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख
Summary
आंसू फिल्म साइटोकिंस का विश्लेषण विभिंन नेत्र रोगों के अध्ययन में मदद करता है । मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख सरल और संवेदनशील है और छोटे संस्करणों के साथ नमूनों में कई लक्ष्यों के परीक्षण को सक्षम करें । यहां हम आंसू फिल्म cytokine एक प्रयोग मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख रूपरेखा के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Abstract
आंसू फिल्म लिपिड, प्रोटीन और खनिज जो आंख की बाहरी सतह को शामिल किया गया है, जिससे स्नेहन, पोषण और अंतर्निहित कोशिकाओं को सुरक्षा प्रदान का एक जटिल मिश्रण है । आंसुओं का विश्लेषण भविष्यवाणी, निदान, और विभिन्न नेत्र रोगों के रोग का निदान के लिए एक उभरते हुए चिह्नों की पहचान के लिए क्षेत्र है । आँसू आसानी से सुलभ हैं और उनके संग्रह गैर इनवेसिव है । इसलिए, आगे बढ़ रही प्रौद्योगिकियों के आंसू में कई analytes की पहचान के लिए प्रमुखता प्राप्त कर रहे है प्रोटीन या metabolite संरचना और रोग की स्थिति के साथ अपने सहयोग में परिवर्तन का अध्ययन । आंसू साइटोकिंस आंख की सतह के स्वास्थ्य का अध्ययन करने और भी शुष्क नेत्र रोग और वसंत नेत्रश्लेष्मलाशोथ जैसे विभिंन नेत्र सतह विकारों के तंत्र को समझने में मदद करने के लिए आदर्श है । मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख एक उच्च संवेदनशीलता के साथ नमूना की एक छोटी राशि में कई analytes का पता लगाने की क्षमता है । यहां हम आंसू नमूना संग्रह, निष्कर्षण और एक मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख का उपयोग cytokine profiling के विश्लेषण के एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Introduction
आँसू अश्रु ग्रंथि और गौण ग्रंथियों और कोट आँख की बाहरी सतह द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । आंसू फिल्म एक बाहरी लिपिड परत और एक भीतरी जलीय परत है कि घुलनशील प्रोटीन, mucins और झिल्ली बंधे mucins शामिल हैं । आँसू माइक्रोबियल आक्रमण, आपूर्ति पोषक तत्वों को रोकने, और आंख की सतह को स्नेहन प्रदान करते हैं । आंसू हवा और कॉर्निया के लिए ऑक्सीजन परिवहन के लिए ऊतक के बीच एक अंतरफलक के रूप में कार्य करते हैं । 1 आंसू फिल्म प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, लिपिड और इलेक्ट्रोलाइट्स से बना है । आंख और मोतियाबिंद की तरह प्रणालीगत रोगों के साथ आंसू प्रोटीन के बीच संघ, शुष्क नेत्र रोग, वसंत नेत्रश्लेष्मलाशोथ, मधुमेह, थायराइड से जुड़े orbitopathy और कैंसर कई अध्ययनों में पहचान की गई है । 2 , 3 , 4 आंसू नमूने microcapillary ट्यूबों या आंसू प्रवाह स्ट्रिप्स (Schirmer स्ट्रिप्स) द्वारा एकत्र किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, Schirmer का परीक्षण कॉर्निया और अपवर्तन शल्य चिकित्सा क्लीनिकों में की गई एक मानक प्रक्रिया है, जिसके परिणाम cytokine विश्लेषण की परख के लिए उपयोग किए जा सकते हैं । गैर इनवेसिव नमूना संग्रह, जैव-नमूना की पहुंच, और विभिंन शारीरिक और रोग की स्थिति के साथ आंसू संरचना के संघ के कई नेत्र और प्रणालीगत रोगों के लिए आंसू फिल्म के एक संभावित स्रोत बनाने के लिए । 4 , 5 , ६
आंसू साइटोकिंस नेत्र सतह स्वास्थ्य और विभिंन नेत्र रोगों के भड़काऊ स्थितियों का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । आंसू के नमूनों में कई साइटोकिंस के 7 असामान्य सांद्रता शुष्क नेत्र रोग, वसंत keratoconjunctivitis (वीकेसी), atopic keratoconjunctivitis (AKC), मौसमी एलर्जी नेत्रश्लेष्मलाशोथ, और uveitis के साथ जुड़े होने की सूचना दी गई । 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 आंसू प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री, वेस्टर्न सोख्ता और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) जैसे पारंपरिक तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है । 14 , 15 हालांकि, इन पद्धतियों की सीमाएं गरीब संवेदनशीलता और प्रत्येक रोगी में एकाधिक आंसू साइटोकिंस के विश्लेषण के लिए आवश्यक नमूना की एक बड़ी मात्रा कर रहे हैं । 16 , 17 मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख के लिए जटिल मिश्रण के नमूनों में कई analytes का विश्लेषण और सफलतापूर्वक आंसू नमूनों पर लागू करने के लिए विभिंन रोगों में कई साइटोकिंस का विश्लेषण विकसित किया गया है । ६ , 18 सैंडविच एलिसा और फ्लो cytometry तकनीक का एक संयोजन इन परख सक्षम करने के लिए एक एकल नमूने में एकाधिक analytes के ठहराव के लिए एलिसा से अधिक संवेदनशील हो । 19 यह विधि नैदानिक नमूनों और सेल कल्चर supernatants की एक किस्म पर लागू किया जा सकता है और कई pathophysiological स्थितियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अध्ययन में मदद करता है । 20 , 21 , 22 , 23 , 24
वहां कई एलिसा के साथ मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख तुलना अध्ययन कर रहे है और तरीकों के बीच एक संबंध की सूचना दी है । लू एट अल. तुलना मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख adiponectin, resistin, लेप्टिन और मानव सीरम या प्लाज्मा नमूनों में ghrelin का पता लगाने के लिए पारंपरिक एलिसा के साथ और परख के बीच एक मजबूत सहसंबंध (r & #62; ०.९) की सूचना दी । 25 ड्यूपॉंट एट अल. मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख और एलिसा के पता लगाने के लिए il-1β, आईएल-4, आईएल-5, आईएल-6, आईएल-10, IFN-υ, और TNF-α में phytohemagglutinin और lipopolysaccharide में एक मजबूत संबंध की सूचना दी पूरे रक्त गर्भवती महिलाओं से एकत्र । 26 पिकरिंग एट अल. मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख और एलिसा के लिए सीरम एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए Haemophilus इंफ्लूएंजा प्रकार बी polysaccharide (आर = 0.96) के बीच एक और मजबूत संबंध की सूचना दी, के toxoids क्लोस्ट्रीडियम tetani (r = 0.96), व Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91) । 27 Biagini एट अल. एक उच्च सकारात्मक सहसंबंध (आर = 0.852) मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख और एलिसा के बीच बैसिलस anthracis विरोधी पीए आईजीजी के सीरम नमूनों में पता लगाने के लिए की सूचना दी । 28 वांग एट अल. ने अल्जाइमर रोग का पता लगाने के लिए मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख और एलिसा के बीच संबंध की सूचना दी amyloid-β ४२ (r = 0.77), कुल ताऊ (आर = 0.94), और ताऊ phosphorylated पर एमिनो एसिड १८१ (आर = 0.82) में मस्तिष्कमेरु द्रव नमूने । 29 इन अध्ययनों से नैदानिक नमूनों की विविधता पर मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया है, छोटे नमूना मात्रा आवश्यकताओं और मानक एलिसा, जो मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख एक होनहार बनाने के साथ एक संबंध विभिंन रोग phenotypes में नमूनों के विभिंन प्रकार में कई analytes का पता लगाने के लिए पारंपरिक एलिसा तरीकों के लिए वैकल्पिक । यहां हम Schirmer स्ट्रिप्स का उपयोग कर स्वस्थ विषयों से एकत्र आंसू नमूनों में ४१ analytes के लिए cytokine की रूपरेखा के लिए मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Protocol
इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए प्रोटोकॉल्स को टैन Tock सेंग हॉस्पिटल, सिंगापुर के इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड ने मंजूरी दी थी ।
1. मानिसहरु Cytokine विश्लेषण आंसू के संग्रह: विषय पू…
Representative Results
Discussion
साइटोकिंस छोटे सेलुलर स्रावित प्रोटीन और शक्तिशाली प्रतिरक्षा मॉडुलन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित कर रहे हैं । ३२ आंसू नमूनों में विभिन्न साइटोकिंस की अभिव्यक्ति प्रोफाइल आंख की …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुसंधान कार्य टैन Tock सेंग अस्पताल निजीकृत बीज अनुदान कार्यक्रम २०१५ से केंद्र अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; सिंगापुर नेत्र अनुसंधान संस्थान पायलट ग्रांट और टैन Tock सेंग अस्पताल की पिच के लिए फंड अनुदान ।
Materials
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
Riferimenti
- Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
- von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
- Pieragostino, D., D’Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
- Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
- Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
- Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
- Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
- Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
- Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
- Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
- Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
- Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
- Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
- Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
- Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
- Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
- Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
- Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer’s disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
- Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
- Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
- Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
- Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
- Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
- Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
- . The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
- Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
- Tighe, O., Negm, I., Todd, L., Fairclough, Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
- Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
- Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O’Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
- Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
- Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
- Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).
