Perla base Multiplex Assay per l'analisi dei profili di Cytokine di lacrima

Summary

Analisi del film lacrimale citochine aiuta a studiare varie malattie oculari. Saggi multiplex perlina basata sono semplici e sensibili e abilitare il testing di bersagli multipli in campioni con piccoli volumi. Qui descriviamo un protocollo per lacrima film cytokine profilatura un mediante perlina basato su analisi multiplex.

Abstract

Film lacrimale è una miscela complessa di lipidi, proteine e minerali che copre la superficie esterna dell’occhio, fornendo in tal modo la lubrificazione, la nutrizione e la protezione alle celle sottostanti. Analisi delle lacrime sono un’area emergente per l’identificazione di biomarcatori per la previsione, diagnosi e prognosi di varie malattie oculari. Le lacrime sono facilmente accessibili e loro insieme è invasivo. Di conseguenza, avanzante tecnologie stanno guadagnando importanza per l’identificazione degli analiti multiple in lacrime per studiare i cambiamenti nella composizione della proteina o del metabolita e la sua associazione con condizioni patologiche. Lacrima citochine sono biomarcatori ideale per studiare la salute della superficie oculare e anche aiutano nella comprensione dei meccanismi di diversi disordini di superficie oculari come malattia dell’occhio asciutta e congiuntivite primaverile. Saggi multiplex perlina base hanno la capacità di rilevare analiti multiple in una piccola quantità di campione con una maggiore sensibilità. Qui descriviamo un protocollo standardizzato di raccolta del campione di lacrima, estrazione ed analisi di cytokine profilatura mediante una perlina basato su analisi multiplex.

Introduction

Le lacrime sono prodotte dalla ghiandola lacrimale e ghiandole accessorie e rivestire la superficie esterna dell’occhio. Film lacrimale è costituito da uno strato lipidico esterno e uno strato acquoso interno che comprende proteine solubili, mucine e membrana associato mucine. Lacrime impediscono l’invasione microbica, forniscono sostanze nutritive e forniscono la lubrificazione alla superficie oculare. Lacrime di fungere da interfaccia tra l’aria ed il tessuto per il trasporto di ossigeno alla cornea. ¹ film lacrimale è costituito da proteine, carboidrati, lipidi ed elettroliti. L’associazione tra proteine di strappo con malattie oculari e sistemiche come glaucoma, malattia dell’occhio secco, congiuntivite primaverile, mellito di diabete, cancro e orbitopatia tiroide-collegato è stato identificato in diversi studi. ^{2 , 3 , 4} lacrima campioni possono essere raccolti da microcapillary tubi o lacrima flusso strips (strisce di Schirmer). Inoltre, test di Schirmer è una procedura standard eseguita nella cornea e cliniche di chirurgia refrattiva, i cui risultati possono essere utilizzati per analisi di analisi di cytokine. Raccolta dei campioni non-invasivo, accessibilità del bio-campione e l’associazione di strappo composizione con varie condizioni fisiologiche e patologiche fanno strappare la pellicola una potenziale fonte di biomarcatori per parecchie malattie oculari e sistemiche. ^{4 , 5 , 6}

Lacrima citochine svolge un ruolo importante nello studio della salute di superficie oculare e condizioni infiammatorie di varie malattie oculari. ⁷ concentrazioni anormali di diverse citochine in campioni di rottura sono state segnalate per essere associati con la malattia dell’occhio asciutta, cheratocongiuntivite primaverile (VKC) e cheratocongiuntivite atopica (AKC), congiuntivite allergica stagionale e uveite. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} lacrima proteine possono essere analizzati con metodi tradizionali come la spettrometria di massa, western blotting e analisi enzima-collegate dell’immunosorbente (ELISA). ^{14 , 15} tuttavia, le limitazioni di questi metodi sono scarsa sensibilità e un più grande volume di campione richiesto per l’analisi delle citochine multiple di lacrima in ogni paziente. ^{16 , 17} saggi multiplex perlina basata sono stati sviluppati per analizzare più analiti nei campioni di miscela complessa e applicati con successo su campioni di lacrima per analizzare più citochine nelle malattie differenti. ^{6 , 18} A combinazione di sandwich ELISA e tecniche di citometria di flusso consentono queste analisi diventare più sensibile dell’ELISA per la quantificazione degli analiti multipli in un singolo campione. ¹⁹ questo metodo può essere applicato su una varietà di campioni clinici e surnatanti della cultura delle cellule e aiuta nello studio delle risposte immunitarie in diverse condizioni fisiopatologiche. ^{20 , 21 , 22 , 23 , 24}

Ci sono parecchi studi confrontando perlina basato multiplex assays con ELISA e hanno segnalato una correlazione tra i metodi. Perlina di Loo et al rispetto basato l’analisi multiplex con ELISA convenzionale per la rilevazione di adiponectina, resistina, leptina e grelina nei campioni di siero o plasma umano e segnalato una forte correlazione (r > 0,9) tra i saggi. ²⁵ Dupont et al ha segnalato una forte correlazione fra saggi multiplex perlina basato ed ELISA per la rilevazione di IL-1 β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ e TNF-α nel phytohemagglutinin e lipopolisaccaride stimolato sangue intero raccolti da donne incinte. ²⁶ Pickering et al ha segnalato un altro forte correlazione tra analisi multiplex perlina basato ed ELISA per la rilevazione degli anticorpi del siero di Haemophilus influenzae tipo b polisaccaride (r = 0,96), tossoidi del Clostridium tetani (r = 0,96) e Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). ²⁷ Biagini et al ha segnalato un’alta correlazione positiva (r = 0,852) tra analisi multiplex perlina basato ed ELISA per il rilevamento di Bacillus anthracis anti-PA IgG nei campioni di siero. ²⁸ Wang et al ha segnalato una correlazione tra analisi multiplex perlina basato ed ELISA per l’individuazione di biomarcatori di malattia di Alzheimer amiloide-β 42 (r = 0.77), tau totale (r = 0.94) e tau fosforilate su aminoacido 181 (r = 0.82) in campioni del liquido cerebrospinale. ²⁹ questi studi hanno dimostrato che l’applicabilità del branello basato multisala saggi su varietà di campioni clinici, minori requisiti di volume di campione e una correlazione con ELISA standard, che rendono saggi multiplex perlina basato un promettente alternativa ai tradizionali metodi ELISA per il rilevamento di più analiti in diversi tipi di campioni in fenotipi differenti di malattia. Qui descriviamo un protocollo standardizzato per l’analisi multiplex perlina basato per la citochina profilatura per 41 analiti in lacrima campioni prelevati da soggetti sani utilizzando strisce di Schirmer.

Protocol

i protocolli utilizzati in questo studio sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale di Tan Tock Seng Hospital, Singapore. 1. analisi di Cytokine strappare collezione di lacrime: chiedere al soggetto di sedersi comodamente su una sedia di esame e posizionare il suo testa contro il poggiatesta. Chiedere al soggetto di cercare, aprire le strisce di Schirmer (fatte di carta da filtro Whatman n. 41) e posizionare l’estremità arroton…

Representative Results

Lacrima campioni sono stati raccolti da 8 occhi di 4 soggetti sani utilizzando strisce di flusso lacrima e livelli di citochina sono stati analizzati utilizzando il protocollo di cui sopra. Tutti gli oggetti erano maschi e l’età delle quattro materie era 36, 42, 44 e 52 anni rispettivamente. Salute di superficie oculare e l’occhio asciutto la malattia è stata valutata da test clinici (lacrima film break up tempo, di Schirmer test, colorazione corneale, colorazione congiuntivale, esame d…

Discussion

Le citochine sono piccole proteine secrete cellulare e potenti modulatori immuni regolazione della risposta immunitaria. ³² i profili di espressione di varie citochine in campioni collegati alle varie circostanze patologiche dell’occhio e studi sulla citochina profili aiutano a capire i meccanismi della patogenesi della malattia, determinare lo stato di salute oculare, lacrima la gravità della malattia, la diagnosi e la progressione. ^{2 ,} Piccolo campione volumi …

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit	Merck, USA	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument	Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software	Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software	BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1	BIO-RAD, France
Plate shaker	Corning, USA
TECAN Microplate Washer	Tecan, Switzerland	HydroSpeed
Vortex Genie 2	Scientific Industries inc, USA	G560E
Pipettes	Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube	Axygen, USA	MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip	Eye Care and Cure, USA	101657
Flexmap 3D Calibration Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-028
Flexmap 3D Verfication Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-029
Ocular examination chair