Live-celle billeddannelse af svampe celler at undersøge tilstande af post og subcellulært lokalisering af svampedræbende plante Defensins
Summary
Anlægget defensins spille en vigtig rolle i plante forsvar mod patogener. Til effektiv brug af disse svampedræbende peptider som svampedræbende agenter, forstå deres former for action (MOA) er kritiske. Her, er en live-celle billedbehandling metode beskrevet til at undersøge kritiske aspekter af MOA af disse peptider.
Abstract
Lille cystein-rige defensins er en af de største grupper af vært forsvar peptider til stede i alle planter. Mange anlæg defensins udviser potent i vitro svampedræbende aktivitet mod et bredt spektrum af svampe patogener og derfor har potentiale til at blive brugt som svampedræbende stoffer i transgene afgrøder. For at udnytte det fulde potentiale af plante defensins for sygdomme kontrol, er det afgørende at belyse deres virkningsmekanismer (MOA). Med fremkomsten af avancerede mikroskopi-teknikker, er live-celle imaging blevet et stærkt værktøj for at forstå dynamikken i de svampedræbende MOA af plante defensins. Her, er en Konfokal mikroskopi baseret live-celle billedbehandling metode beskrevet ved hjælp af to fluorescently mærket plante defensins (MtDef4 og MtDef5) i kombination med vitale fluorescerende farvestoffer. Denne teknik gør det muligt for real-time visualisering og analyse af de dynamiske begivenheder i MtDef4 og MtDef5 internalisering i svampe celler. Vigtigst, genererer denne assay et væld af oplysninger inklusive internalisering kinetik, tilstand af post og subcellulært lokalisering af disse peptider. Sammen med andre celle biologiske funktioner, har disse metoder givet kritisk indsigt i dynamikken og kompleksiteten af MOA af disse peptider. Disse værktøjer kan også bruges til at sammenligne MOA af disse peptider mod forskellige svampe.
Introduction
Planter har udviklet et sofistikeret medfødte immunsystem til forsvar mod mikrobielle plante patogener1. De giver udtryk for talrige gen-kodet vært forsvar peptider med formodede antimikrobiel aktivitet2. Ja, mange af disse peptider vise antimikrobiel aktivitet in vitro-3. Defensins omfatter en af de største grupper af vært forsvar peptider i anlægget Kongerige4. Disse cystein-rige, kationiske peptider udstille potent vækst hæmmende aktivitet mod svampe og oomycet patogener på micromolar koncentrationer og repræsenterer en af de første linjer i forsvar mod disse patogener5,6. På grund af deres potent svampedræbende aktivitet, kan defensins udnyttes i agribiotechnological applikationer til at generere sygdomsresistente afgrøder. Konstituerende overekspression af flere plante defensins har vist sig at forbedre sygdomsresistens i drivhus og field test af transgene afgrøder6. Det er vigtigt at optrævle virkningsmekanismer (MOA) af disse svampedræbende peptider for at fuldt ud for at udnytte deres potentiale som effektive værktøjer for afgrødebeskyttelse. Dog er MOA af disse anlæg defensins dårligt forstået. Nuværende tyder på, at de udviser forskellige MOA5,6,7,8. Nogle defensins handle extracellularly på svampe og målrette specifikke cellevæg/plasma membran bopæl sphingolipids, forstyrre membran integritet og aktivere cellulære toksicitet veje9,10,11. For nylig har svampedræbende defensins, der translocate i svampe celler blevet opdaget12,13,14. Nogle af disse defensins binder sig til membranen-resident bioaktive fosfolipider, danne oligomere komplekser og permeabilize plasma membraner15,16,17. Således har blevet belyst visse aspekter af MOA af plante defensins. Dog indebærer MOA af planten defensins sandsynligvis et komplekst sæt af begivenheder, der endnu ikke er blevet identificeret og integreres i en omfattende model. Især er der stadig et stort hul i vores forståelse af disse peptider cellulære mål.
Med de seneste fremskridt i mikroskopi teknologier og udvikling af nye fluorescerende sonder, er live-celle Billeddannende teknikker nu ofte bruges til at studere MOA af antimikrobielle peptider (AMP’er). Disse teknikker supplere udbredte metoder såsom immunolocalization, elektronmikroskopi, atomic force mikroskopi eller X-ray computertomografi18, som har været ansat for det meste til at analysere virkningen af svampemidler peptider på morfologi og vækst af svampe celler herunder studiet af cellevæggen integritet, ændringer i celle vækst/forgrening mønstre samt plasma membran permeabilization og drab. Alligevel, disse undersøgelser har været begrænset til imaging celler på en bestemt tid efter behandling med peptider i stedet for at udføre time-lapse imaging på de samme celler til at overvåge deres dynamiske ændringer som reaktion på defensin udfordring. I de seneste år, har brugen af fluorescently mærket peptider i forbindelse med levende celle imaging ved hjælp af konfokalmikroskopi aktiveret real-time visualisering af dynamikken i AMP-mikrobe interaktioner. Både naturligt renset og kemisk syntetiseret svampedræbende peptider kan mærkes med fluorescerende etiketter (f.eks., DyLight, rodamin, BODIPY eller Alexa Fluor baseret farvestoffer) og direkte observeret under deres interaktion med celler af time-lapse Live-celle billeddannelse. Brugen af disse mærket peptider steget betydeligt vores forståelse af de forskellige aspekter af deres MOA, herunder tilstand af indrejse, subcellulært lokalisering, intracellulære handel og websteder af svampedræbende handling inden for levende svampe celler 18.
For nylig, flere undersøgelser har vist, at forskellige svampedræbende peptider herunder plante defensins er internaliseret af levende svampe celler12,14,19,20. MOA om disse defensins sandsynligvis indebærer interaktion med intracellulære mål. Vi har for nylig rapporteret en plante defensin MtDef4 i to ascomycete svampe, Neurospora crassa og Fusarium graminearumsvampedræbende indsats. MtDef4 viste sig at bruge forskellige veje til svampe celleindtastning og subcellulært lokalisering i disse svampe14. Denne undersøgelse anvendes kemisk syntetiseret tetramethyl rodamin (TAMRA)-mærket MtDef4 i kombination med vitale fluorescerende farvestoffer (membran selektiv farvestof, FM4-64, membran-permeant farvestof, SYTOX grøn, celle død reporter farvestof, propidium Iodid) og metaboliske hæmmere. Disse analyser udviste kinetik af internaliseringen af MtDef4, dens mekanismer af intracellulær transport og dens subcellulært mål14.
Her, er en protokol for live-celle imaging ved hjælp af Konfokal mikroskopi præsenteret. Protokollen udnytter fluorescently mærket peptider i kombination med vitale fluorescerende farvestoffer til at studere plante defensin-svampe interaktioner, navnlig, veje af translokation og intracellulære mål for defensins i svampe celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse blev en pålidelig live-celle billedbehandling metode med brug af fluorescently mærket svampedræbende defensins beskrevet til at studere kinetik internalisering af disse peptider ind svampe celler af og bestemme deres subcellulært mål. Denne metode er et kraftfuldt værktøj til at visualisere dynamikken i samspillet mellem defensins og svampe celler, tidsmæssigt og rumligt.
Forskellige metoder er blevet brugt til at studere internalisering og intracellulære lokalis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. R. Howard Berg, direktør for den integrerede mikroskopi facilitet på Donald Danforth Plant Science Center, for hans vejledning og hjælpe med Konfokal mikroskopi. Forfatterne har nogen interessekonflikt at erklære.
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
Riferimenti
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
- Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
- De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
- Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?. Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
- Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
- Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
- Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
- Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
- Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
- Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
- Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. Biochimica. 46 (4), 987-996 (2007).
- El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
- Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
- Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
- Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808 (2014).
- Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248 (2012).
- Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
- Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
- Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium. laboratory manual. , (2006).
- Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
- Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
- Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
- Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).
- Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542 (2017).
