אנו מדגימים שיטה לתמונה מולקולות מרובות בתוך מבנים ננו הטרוגניים בדייקנות מולקולה בודדת, תוך שימוש בחוזקה מחודשת ובזהירות של נוגדנים שכותרתו fluorescently.
הדמיה מבנים הסלולר הטרוגנית באמצעות מיקרוסקופית מולקולה אחת מולקולה כבר הפריע על ידי דיוק לוקליזציה מספקת יכולת ריבוב. באמצעות נוי פלורסנט סמנים fiducial ננו, אנו מתארים את תיקון סחיפה הליכי יישור נדרש להשיג דיוק גבוהה מיקרוסקופית לוקליזציה מולקולה אחת. בנוסף, אסטרטגיה חדשה ריבוב, madSTORM, מתואר שבו מולקולות מרובות ממוקדות באותו תא באמצעות מחייב רציף elution של נוגדנים פלורסנט. MDSTORM מודגם על תא T מופעל כדי לדמיין את מיקומם של מרכיבים שונים בתוך מבנה מרובה חלבון, מרובת חלבון הנקרא מיקרו קולסטר קולטן התא. בנוסף, היישום של madSTORM ככלי כללי להדמיה של מבנים רב חלבונים נדון.
מגוון רחב של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה טכניקות פותחו כדי להתגבר על גבול עקיפה של מיקרוסקופ אור (~ 200 ננומטר). בין אלה היא קטגוריה של טכניקות הנקראות מולקולה מולקולה לוקליזציה מיקרוסקופית (SMLM) הכוללת צילום לוקליזציה לוקליזציה מיקרוסקופ (PALM) ו סטוכסטי שחזור אופטי מיקרוסקופ (STORM). טכניקות SMLM לשתף את השימוש fluorophores כי ניתן לעבור בין (פלורסנט) ו כבוי (כהה / צילום), המאפשר לוקליזציה רצף של הקרינה מ מולקולות בודדות 1 , 2 , 3 .
בשל תאימותו עם צבעים מסחריים זמינים מיקרוסקופים, ישיר STORM (dSTORM) הפך טכניקה SMLM שאומצה נרחב 4 . DSTORM יכול להשיג באופן קבוע ~ 10 ננומטר לוקליזציה דיוק, מוגדר אי ודאות בחישוב מרכז diffractיון מוגבל נקודת פונקציית התפשטות (PSF). עם זאת, למרות דיוק גבוהה מוערך באמצעות אלגוריתמים לוקליזציה 5 , 6 , 7 , קביעת מדויקת של המיקום בפועל של מולקולות בודדות כבר הקשו על ידי מספר נושאים. ראשית, תנועה מכנית של הבמה מיקרוסקופ במהלך רכישת התמונה מוסיף אי ודאות משמעותית דיוק לוקליזציה. כמו תמונות SMLM מתקבלים במשך אלפי מסגרות זמן לשגות, תנועות בקנה מידה ננו של הבמה מיקרוסקופ יכול לפגוע באופן משמעותי את הדיוק של התמונה ברזולוציה הסופי הסופי 8 . כדי לפצות על תנועת הבמה במהלך רכישת התמונה, סחיפה שלב הוא מוערך בדרך כלל מן ההתאמה מבוסס רגרסיה של לוקליזציה binned מן התמונה עצמה (קורלציה צולבת) או לוקליזציות רצף מ סמנים fiducial (תיקון fiducial) 1 , 9 . Howevאה, שיטות אלה דורשים אופטימיזציה של פרמטרים מרובים עבור כל מחסנית תמונה, ולא יכול להסביר את תנועות הבמה על קשקשים זמן קצר כגון רטט מכני. ננו-חלקיקי זהב וחרוזי ניאון רב-צבעוניים שימשו סמנים fiducial ב- SMLM, אך הם אינם תמונה יציבה, וכתוצאה מכך דיוק נמוך משמעותית לאחר תיקון סחיפה מאשר חנקן מרכז ניאון פלואורסצנטי נינו-יהלומים (FNDs) בשימוש In madSTORM 10 .
בנוסף למגבלה עקיפה, מיקרוסקופ אור מוגבלים עוד יותר על ידי גבולות ספקטרליים. הדמיה סימולטנית של מטרות מרובות דורש בדיקות פלואורסצנטי עם שאינם חופפים פרופילים ספקטרלית, בדרך כלל הגבלת מיקרוסקופ אור מבוסס פלואורסצנטי ל 6 צבעים ו SMLM ל 2-3 צבעים 4 , 11 , 12 . יתר על כן, סטייה כרומטית לא ליניארית גורמת לאי-התאמה של תמונות רב-גוניות, wHich דורשים נהלים יישור נרחב באמצעות סמנים fiducial רב צבעוני 8 , 13 . כדי להתגבר על המגבלות הללו, מחקרים קודמים צילמו מספר מטרות באמצעות photobleaching חוזרות או מרווה כימית של fluorophores 14 ברצף , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . בעוד שיטות אלה יכולים להתגבר על גבולות ספקטרליים של מיקרוסקופיה, הלבנת הקרינה ידוע להיות תהליך רעיל 20 , הלבנה ממושכת או מרווה עלול לגרום לתופעות לוואי לא רצויות כגון אובדן crosslinking. יתר על כן, הצטברות של בדיקות ניאון יכול להוביל חסימה סטרית של אתרי מחייב במדגם, מניעת ריבוב בקנה מידה גדול ומיקוד חזקים של epitopes. כדי למנוע הפרעות סטריליות כאלה, s האחרונותTudy מושגת ריבוב באמצעות חילופי סטוכסטיים של שברי חלבונים מתפזרים באופן חופשי 21 . בעוד שיטה זו מאפשרת תיוג צפוף של מבנים הסלולר, זה דורש הכנה ביוכימי נרחב לבודד שברים פפטיד, לא ניתן לאתר עמדות מולקולה אחת, ולא בקלות להקל על ריבוב בקנה מידה גדול באמצעות בדיקות זמינות מסחרית. אנו מציגים פרוטוקול וידאו מפורט המתאר את מחייב רציף elution של נוגדנים fluorescently עבור multiplexed, נוגדן גודל מוגבל dSTORM (מדסטורם) הדמיה, ושימוש של ננו פלורסנט יהלומים כדי להשיג תיקון סחיפה מדויקת ויישור.
ההעתקה הסידורית, תיקון הסחיפה ויישורי היישור ב- madStORM מאפשרים הדמיה מדויקת ומרובת מאוד של מבנים הטרוגניים בתאים. 10 בנוסף, MadSTORM נמנע את המגבלות של צבע רב STORM כגון סטייה כרומטית ותת-אופטימלי photoswitching / תכונות פליטה של צבעי אדום לא 9 , <sup cla…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים Xufeng וו עבור גישה למיקרוסקופ STORM. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר הפנימי של המרכז הלאומי לסרטן (NCI) מרכז לחקר הסרטן ואת הלב הלאומי לבריאות דם המכון (NHLBI).
8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |