डीएनए घावों पर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए उन्नत फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीक
Summary
लेजर microirradiation जीवित कोशिकाओं में डीएनए की मरंमत के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है । विभिन्न डीएनए घावों को प्रेरित करने के लिए UVA पराबैंगनीकिरण के उपयोग के लिए एक methodological दृष्टिकोण दिखाया गया है । हम स्थानीय microirradiation है कि सामांय कोशिका चक्र का कहना है के लिए एक विधि अनुकूलित है; इस प्रकार विकिरणित कोशिकाएँ बँटवारा के माध्यम से आगे बढ़ती हैं.
Abstract
पराबैंगनीकिरण के साथ स्थानीय microirradiation जीवित कोशिकाओं में डीएनए की मरंमत से संबंधित प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । यहाँ, हम समय पर डीएनए घावों पर प्रोटीन कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए एक methodological दृष्टिकोण का वर्णन या स्थानीय रूप से microirradiated क्रोमेटिन पर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत. हम यह भी बताते है कि कोशिका चक्र के व्यक्तिगत चरणों को पहचानने के लिए Fucci सेलुलर प्रणाली का उपयोग कर कोशिका चक्र पर निर्भर प्रोटीन कैनेटीक्स डीएनए घावों पर अध्ययन करने के लिए । डीएनए क्षति के विभिंन प्रकारों को प्रेरित करने के लिए दो यूवी पराबैंगनीकिरण (३५५ एनएम और ४०५ एनएम) के उपयोग का एक methodological वर्णन भी प्रस्तुत किया है । केवल ४०५-एनएम डायोड लेजर द्वारा microirradiated कोशिकाओं का बँटवारा सामान्य रूप से आगे बढ़ गया और cyclobutane न्यूक्लियोटाइड dimers (CPDs) से रहित थे. हम यह भी बताएंगे कि कैसे microirradiated कोशिकाओं ब्याज की अंतर्जात प्रोटीन के immunodetection प्रदर्शन करने के लिए एक निश्चित समय बिंदु पर तय किया जा सकता है । डीएनए की मरंमत के अध्ययन के लिए, हम इसके अतिरिक्त FRAP (Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली) और FLIM (प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी) के साथ कोशिकाओं में सहज होने वाली डीएनए क्षति घावों सहित भौतिक तरीकों के उपयोग का वर्णन । हम प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रायोगिक अध्ययनों में FLIM-झल्लाहट (प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा अंतरण) का एक आवेदन भी दिखाते हैं.
Introduction
डीएनए क्षति डीएनए cyclobutane न्यूक्लियोटाइड dimers (CPDs), 8-oxo-7, 8-dihydro-2′-deoxyguanosine, और एकल-किनारा या डबल-कतरा टूटता है1,2से मिलकर घावों की उपस्थिति की ओर जाता है । γ-किरणों उच्चतम ऊर्जा और उच्च penetrance के साथ विकिरण का रूप है, इस प्रकार विकिरण के इस स्रोत व्यापक रूप से रेडियोथेरेपी3में प्रयोग किया जाता है । दूसरी ओर, प्रयोग प्रेरित डीएनए यूवी लेजर की वजह से नुकसान यूवी प्रकाश के लिए प्राकृतिक जोखिम की नकल । UVA microirradiation, एक सूक्ष्म विधि के रूप में, व्यक्तिगत जीवन की कोशिकाओं में डीएनए क्षति का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । Microirradiation पहली बार के लिए इस्तेमाल किया गया था ४० साल पहले के लिए गुणसूत्र क्षेत्रों4,5के संगठन प्रकट करने के लिए । यह तकनीक या तो फोकल सूक्ष्मदर्शी के कार्यात्मक गुणों या आधुनिक nanoscopy की तकनीकी सीमाओं पर अत्यधिक निर्भर है । डीएनए घावों को प्रेरित करने के लिए, कोशिकाओं 5 ‘ bromodeoxyuridine (BrdU) या Hoechst ३३३४२ से पहले यूवी विकिरण के लिए संवेदनशील हो सकता है । Bártová एट अल. 6 पहले से संवेदनशीलता कदम वर्णित है, और हाल ही में हम इस microirradiation तकनीक अनुकूलित क्रम में कोशिका मृत्यु, या apoptosis से बचने के लिए । उदाहरण के लिए, एक ४०५-एनएम यूवी लेजर के उपयोग (Hoechst ३३३४२ अधिकता के बिना) 53BP1 की प्रेरण-सकारात्मक डबल-किनारा टूटता है (DSBs) cyclobutane न्यूक्लियोटाइड dimers (CPDs) की कीमत पर होता है । दूसरी ओर, संवेदनशील यूवी microirradiation के साथ संयुक्त कदम CPDs और DSBs एक साथ7,8के बहुत उच्च स्तर प्रेरित । यह पद्धति एक भी डीएनए की मरंमत मार्ग के अध्ययन के लिए लागू करने के लिए मुश्किल है ।
microirradiation के साथ, यह प्रोटीन भर्ती का विश्लेषण करने के लिए संभव है, कैनेटीक्स, और जीवित कोशिकाओं में डीएनए घावों पर बातचीत. इस विधि का एक उदाहरण Luijsterburg एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था । 9 heterochromatin प्रोटीन 1β के लिए, और हम हाल ही में पहली बार के लिए पता चला है कि pluripotency कारक Oct4 और एक प्रोटीन Cajal निकायों के साथ जुड़े, coilin, यूवी प्रेरित डीएनए घावों के लिए भर्ती कर रहे हैं6,10. इन डीएनए घावों पर प्रोटीन कैनेटीक्स भी FRAP का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है (Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली)11,12,13 या झल्लाहट (प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण) तकनीक14 ,15. इन तरीकों को डीएनए घावों या प्रोटीन प्रोटीन बातचीत में प्रोटीन का सरल प्रसार प्रकट करने की क्षमता है । प्रोटीन के अतिरिक्त लक्षण वर्णन के लिए एक उपयोगी उपकरण FLIM (प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी) या झल्लाहट प्रौद्योगिकी के साथ इसके संयोजन (झल्लाहट-FLIM)16है । इन तरीकों कि छुरा या क्षणिक एक फ्लोरोसेंट अणु17द्वारा टैग ब्याज की प्रोटीन व्यक्त कर रहे है जीवित कोशिकाओं में प्रक्रियाओं के अध्ययन में सक्षम । यहां, GFP के लिए घातीय क्षय समय (τ) का एक उदाहरण-टैग p53 प्रोटीन और उसके संपर्क साथी, mCherry-टैग 53BP1, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है18,19 दिखाया गया है । पैरामीटर τ, FLIM गणना द्वारा प्रदान की fluorochrome के जीवनकाल, एक दिया प्रतिदीप्ति डाई के लिए विशिष्ट है, अपनी बाध्यकारी क्षमताओं, और अपने सेलुलर वातावरण. इसलिए, इस विधि हमें प्रोटीन उपआबादी के बीच भेद दिखा सकते हैं, उनकी बाध्यकारी क्षमता, और उनके कार्यात्मक गुण के बाद, उदाहरण के लिए, डीएनए क्षति ।
यहां, उंनत माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है के methodological दृष्टिकोण की एक रूपरेखा समय विशिष्ट प्रोटीन भर्ती, कैनेटीक्स, प्रसार, और microirradiated क्रोमेटिन के स्थल पर प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रस्तुत है । जीवित कोशिकाओं में स्थानीय डीएनए घावों की प्रेरण के लिए कदम दर कदम पद्धति है, और डीएनए के अध्ययन के लिए उपयोगी तरीके का वर्णन-नुकसान-स्थानीय रूप से प्रेरित डीएनए यूवी पराबैंगनीकिरण की वजह से घावों पर घटनाओं से संबंधित प्रदान की जाती हैं ।
Protocol
1. सेल लाइंस की खेती हेला-व्युत्पन्न सेल लाइंस नोट: हेला ग्रीवा कार्सिनोमा कोशिकाओं का उपयोग करें: या तो हेला कोशिकाओं छुरा citrullinated H2B के साथ टैग की गईं GFP या हेला-Fucci एक्सप्रेस आरएफपी-Cdt1 कोशिका?…
Representative Results
Discussion
सूक्ष्म तकनीक अनुसंधान प्रयोगशालाओं में बुनियादी उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं । यहां डीएनए घावों पर प्रोटीन भर्ती और कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों का संक्षिप्त विवरण…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चेक गणराज्य की ग्रांट एजेंसी, प्रोजेक्ट P302-12-G157 ने सपोर्ट किया था । प्रयोग भी चेक-नार्वे अनुसंधान कार्यक्रम CZ09, जो नार्वे कोष द्वारा निगरानी की है द्वारा समर्थित थे, और शिक्षा, युवा और चेक गणराज्य के खेल के मंत्रालय द्वारा (अनुदान संख्या: 7F14369) ।
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
Riferimenti
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
- Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
- Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
- Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
- Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
- Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
- Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
- Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
- Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
- Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
- Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
- Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
- Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
- Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
- Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
- Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
- Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
- Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
- Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
- Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
