लेजर microirradiation जीवित कोशिकाओं में डीएनए की मरंमत के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है । विभिन्न डीएनए घावों को प्रेरित करने के लिए UVA पराबैंगनीकिरण के उपयोग के लिए एक methodological दृष्टिकोण दिखाया गया है । हम स्थानीय microirradiation है कि सामांय कोशिका चक्र का कहना है के लिए एक विधि अनुकूलित है; इस प्रकार विकिरणित कोशिकाएँ बँटवारा के माध्यम से आगे बढ़ती हैं.
पराबैंगनीकिरण के साथ स्थानीय microirradiation जीवित कोशिकाओं में डीएनए की मरंमत से संबंधित प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । यहाँ, हम समय पर डीएनए घावों पर प्रोटीन कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए एक methodological दृष्टिकोण का वर्णन या स्थानीय रूप से microirradiated क्रोमेटिन पर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत. हम यह भी बताते है कि कोशिका चक्र के व्यक्तिगत चरणों को पहचानने के लिए Fucci सेलुलर प्रणाली का उपयोग कर कोशिका चक्र पर निर्भर प्रोटीन कैनेटीक्स डीएनए घावों पर अध्ययन करने के लिए । डीएनए क्षति के विभिंन प्रकारों को प्रेरित करने के लिए दो यूवी पराबैंगनीकिरण (३५५ एनएम और ४०५ एनएम) के उपयोग का एक methodological वर्णन भी प्रस्तुत किया है । केवल ४०५-एनएम डायोड लेजर द्वारा microirradiated कोशिकाओं का बँटवारा सामान्य रूप से आगे बढ़ गया और cyclobutane न्यूक्लियोटाइड dimers (CPDs) से रहित थे. हम यह भी बताएंगे कि कैसे microirradiated कोशिकाओं ब्याज की अंतर्जात प्रोटीन के immunodetection प्रदर्शन करने के लिए एक निश्चित समय बिंदु पर तय किया जा सकता है । डीएनए की मरंमत के अध्ययन के लिए, हम इसके अतिरिक्त FRAP (Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली) और FLIM (प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी) के साथ कोशिकाओं में सहज होने वाली डीएनए क्षति घावों सहित भौतिक तरीकों के उपयोग का वर्णन । हम प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रायोगिक अध्ययनों में FLIM-झल्लाहट (प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा अंतरण) का एक आवेदन भी दिखाते हैं.
डीएनए क्षति डीएनए cyclobutane न्यूक्लियोटाइड dimers (CPDs), 8-oxo-7, 8-dihydro-2′-deoxyguanosine, और एकल-किनारा या डबल-कतरा टूटता है1,2से मिलकर घावों की उपस्थिति की ओर जाता है । γ-किरणों उच्चतम ऊर्जा और उच्च penetrance के साथ विकिरण का रूप है, इस प्रकार विकिरण के इस स्रोत व्यापक रूप से रेडियोथेरेपी3में प्रयोग किया जाता है । दूसरी ओर, प्रयोग प्रेरित डीएनए यूवी लेजर की वजह से नुकसान यूवी प्रकाश के लिए प्राकृतिक जोखिम की नकल । UVA microirradiation, एक सूक्ष्म विधि के रूप में, व्यक्तिगत जीवन की कोशिकाओं में डीएनए क्षति का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । Microirradiation पहली बार के लिए इस्तेमाल किया गया था ४० साल पहले के लिए गुणसूत्र क्षेत्रों4,5के संगठन प्रकट करने के लिए । यह तकनीक या तो फोकल सूक्ष्मदर्शी के कार्यात्मक गुणों या आधुनिक nanoscopy की तकनीकी सीमाओं पर अत्यधिक निर्भर है । डीएनए घावों को प्रेरित करने के लिए, कोशिकाओं 5 ‘ bromodeoxyuridine (BrdU) या Hoechst ३३३४२ से पहले यूवी विकिरण के लिए संवेदनशील हो सकता है । Bártová एट अल. 6 पहले से संवेदनशीलता कदम वर्णित है, और हाल ही में हम इस microirradiation तकनीक अनुकूलित क्रम में कोशिका मृत्यु, या apoptosis से बचने के लिए । उदाहरण के लिए, एक ४०५-एनएम यूवी लेजर के उपयोग (Hoechst ३३३४२ अधिकता के बिना) 53BP1 की प्रेरण-सकारात्मक डबल-किनारा टूटता है (DSBs) cyclobutane न्यूक्लियोटाइड dimers (CPDs) की कीमत पर होता है । दूसरी ओर, संवेदनशील यूवी microirradiation के साथ संयुक्त कदम CPDs और DSBs एक साथ7,8के बहुत उच्च स्तर प्रेरित । यह पद्धति एक भी डीएनए की मरंमत मार्ग के अध्ययन के लिए लागू करने के लिए मुश्किल है ।
microirradiation के साथ, यह प्रोटीन भर्ती का विश्लेषण करने के लिए संभव है, कैनेटीक्स, और जीवित कोशिकाओं में डीएनए घावों पर बातचीत. इस विधि का एक उदाहरण Luijsterburg एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था । 9 heterochromatin प्रोटीन 1β के लिए, और हम हाल ही में पहली बार के लिए पता चला है कि pluripotency कारक Oct4 और एक प्रोटीन Cajal निकायों के साथ जुड़े, coilin, यूवी प्रेरित डीएनए घावों के लिए भर्ती कर रहे हैं6,10. इन डीएनए घावों पर प्रोटीन कैनेटीक्स भी FRAP का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है (Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली)11,12,13 या झल्लाहट (प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण) तकनीक14 ,15. इन तरीकों को डीएनए घावों या प्रोटीन प्रोटीन बातचीत में प्रोटीन का सरल प्रसार प्रकट करने की क्षमता है । प्रोटीन के अतिरिक्त लक्षण वर्णन के लिए एक उपयोगी उपकरण FLIM (प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी) या झल्लाहट प्रौद्योगिकी के साथ इसके संयोजन (झल्लाहट-FLIM)16है । इन तरीकों कि छुरा या क्षणिक एक फ्लोरोसेंट अणु17द्वारा टैग ब्याज की प्रोटीन व्यक्त कर रहे है जीवित कोशिकाओं में प्रक्रियाओं के अध्ययन में सक्षम । यहां, GFP के लिए घातीय क्षय समय (τ) का एक उदाहरण-टैग p53 प्रोटीन और उसके संपर्क साथी, mCherry-टैग 53BP1, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है18,19 दिखाया गया है । पैरामीटर τ, FLIM गणना द्वारा प्रदान की fluorochrome के जीवनकाल, एक दिया प्रतिदीप्ति डाई के लिए विशिष्ट है, अपनी बाध्यकारी क्षमताओं, और अपने सेलुलर वातावरण. इसलिए, इस विधि हमें प्रोटीन उपआबादी के बीच भेद दिखा सकते हैं, उनकी बाध्यकारी क्षमता, और उनके कार्यात्मक गुण के बाद, उदाहरण के लिए, डीएनए क्षति ।
यहां, उंनत माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है के methodological दृष्टिकोण की एक रूपरेखा समय विशिष्ट प्रोटीन भर्ती, कैनेटीक्स, प्रसार, और microirradiated क्रोमेटिन के स्थल पर प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रस्तुत है । जीवित कोशिकाओं में स्थानीय डीएनए घावों की प्रेरण के लिए कदम दर कदम पद्धति है, और डीएनए के अध्ययन के लिए उपयोगी तरीके का वर्णन-नुकसान-स्थानीय रूप से प्रेरित डीएनए यूवी पराबैंगनीकिरण की वजह से घावों पर घटनाओं से संबंधित प्रदान की जाती हैं ।
1. सेल लाइंस की खेती हेला-व्युत्पन्न सेल लाइंस नोट: हेला ग्रीवा कार्सिनोमा कोशिकाओं का उपयोग करें: या तो हेला कोशिकाओं छुरा citrullinated H2B के साथ टैग की गईं GFP या हेला-Fucci एक्सप्रेस आरएफपी-Cdt1 कोशिका?…
सूक्ष्म तकनीक अनुसंधान प्रयोगशालाओं में बुनियादी उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं । यहां डीएनए घावों पर प्रोटीन भर्ती और कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों का संक्षिप्त विवरण…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को चेक गणराज्य की ग्रांट एजेंसी, प्रोजेक्ट P302-12-G157 ने सपोर्ट किया था । प्रयोग भी चेक-नार्वे अनुसंधान कार्यक्रम CZ09, जो नार्वे कोष द्वारा निगरानी की है द्वारा समर्थित थे, और शिक्षा, युवा और चेक गणराज्य के खेल के मंत्रालय द्वारा (अनुदान संख्या: 7F14369) ।
Cell cultivation | |||
HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell transfection | |||
GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Confocal microscopy | |||
Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
White-light laser | Leica Microsystems | ||
355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunofluorescence staining | |||
Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |